CTCF结合与LAD边界的关联分析
探究CTCF结合与LAD边界位置的关系，以及CTCF边界的特征。
比较多个细胞系中CTCF ChIP-seq与NL相互作用图谱，检查CTCF在LAD边界的富集、方向性、以及与活性基因和组蛋白修饰的关系。
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CTCF和cohesin促进DNA从核纤层的局部脱离
CTCF and cohesin promote focal detachment of DNA from the nuclear lamina
实验完整度
高包含快速蛋白耗竭（AID系统）、pA-DamID、ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq等多层级实验，以及体外细胞模型和多种遗传扰动验证，功能验证和机制验证明确。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESCs，E14Tg2a） mESC衍生AID-tagged CTCF、RAD21、WAPL及CTCF/WAPL双耗竭细胞系 F121-9-CASTx129 mESCs及mNPCs
重点核对
CTCF、RAD21、WAPL急性耗竭的效率和动力学（AID系统，IAA浓度、处理时间） 细胞周期分布（EdU/DAPI染色流式分析）对NL相互作用的潜在影响 pA-DamID数据的质量控制（动态范围、z-score转换、生物学重复） LAD边界分类：CTCF结合位点与LAD边界距离（20kb内）、活性基因排除标准（FPKM>1） 蛋白耗竭对基因表达的影响（RNA-seq差异表达分析）
摘要
背景：核纤层相关结构域（LADs）是位于核纤层的大型基因组区域。目前尚不清楚是什么驱动LADs的定位和边界划分。由于绝缘子蛋白CTCF富集在LAD边界，推测CTCF结合可能定位某些LAD边界，可能通过其停滞cohesin并因此防止cohesin侵入LAD的功能。为了验证这一点，我们在快速去除CTCF和其他干扰cohesin动力学后，绘制了小鼠胚胎干细胞中的基因组-核纤层相互作用图谱。结果：CTCF和cohesin有助于LAD边界处核纤层相互作用的急剧转变，而在去除这些蛋白质后，LADs得以维持，即使是在CTCF标记的边界处也是如此。因此，CTCF和cohesin可能增强LAD边界，但不定位于这些边界。LAD内的CTCF结合位点与核纤层局部脱离，并富含可接近的DNA和活性组蛋白修饰。值得注意的是，尽管核纤层定位与基因组失活高度相关，但这些DNA在CTCF耗竭后局部脱离丧失后仍保持可接近。在染色体尺度上，cohesin耗竭和通过去除卸载因子WAPL稳定cohesin定量影响核纤层相互作用，表明核内染色体定位受到干扰。最后，虽然H3K27me3在CTCF标记的LAD边界局部富集，但未发现CTCF与H3K27me3在核纤层相互作用上存在相互作用的证据。结论：这些发现表明CTCF和cohesin并非LAD模式的主要决定因素。相反，这些蛋白质局部调节NL相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CTCF和cohesin是否决定LAD的边界定位，以及它们如何影响基因组与核纤层的相互作用？
- 核心机制
- CTCF和cohesin介导局部DNA环挤出，将CTCF结合位点从核纤层脱离，从而增强LAD边界而非决定其位置；稳定cohesin可导致更大规模的核周定位改变。
- 主要证据
- 通过pA-DamID在CTCF、RAD21、WAPL耗竭后检测NL相互作用，发现局部脱离丧失，但LAD整体模式不变；ATAC-seq显示脱离不维持DNA可及性。
- 研究意义
- 揭示了CTCF和cohesin并非LAD定位的主要决定因素，而是局部调节核纤层相互作用，对理解基因组三维组织与核纤层的功能关系有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CTCF急性和长期耗竭对NL相互作用的影响
测试CTCF是否直接参与LAD边界定位。
使用CTCF-AID mESC系，加入IAA快速耗竭CTCF，在0、6、24、96小时进行pA-DamID检测NL相互作用，分析LAD边界和整体模式变化。
Cohesin动力学扰动对NL相互作用的影响
测试cohesin是否也参与LAD边界和局部脱离。
使用RAD21-AID、WAPL-AID及CTCF/WAPL双AID mESC系，IAA诱导蛋白耗竭，通过pA-DamID检测NL相互作用变化，并分析LAD边界移动和局部脱离。
CTCF结合位点局部脱离的机制探究
探究CTCF结合位点从核纤层局部脱离的机制。
分析LAD内CTCF结合位点的NL相互作用、染色质可及性、组蛋白修饰、环锚重叠，计算脱离分数，并检测蛋白耗竭对ATAC-seq信号的影响。
基因组规模NL相互作用变化的分析
探究CTCF和cohesin对整体NL相互作用模式的影响。
计算所有条件下LAD的pA-DamID分数变化，分析LAD特征（大小、CTCF密度、基因密度、组蛋白修饰等）与变化的相关性，并评估与转录变化的关系。
H3K27me3与CTCF的独立作用验证
测试H3K27me3是否与CTCF在LAD边界定位上具有相互作用。
使用H3K27me3甲基转移酶抑制剂GSK126和EED226处理CTCF-AID细胞，结合或不结合IAA诱导CTCF耗竭，通过pA-DamID检测NL相互作用，并检测H3K27me3 ChIP-seq。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| Neurobasal培养基 | Gibco | -- | |
| N-2添加剂 | Gibco | -- | |
| B-27添加剂 | Gibco | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Gibco | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| MEK抑制剂PD0325901 | Selleckchem | -- | |
| GSK-3β抑制剂CHIR99021 | Cayman Chemical | -- | |
| 1-硫代甘油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 明胶 | -- | -- | |
| 蛋白耗竭 | 生长素（IAA） | Sigma-Aldrich | I5148-10G |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 11697498001 |
| RIPA裂解缓冲液 | -- | -- | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris预制胶 | ThermoFisher SCIENTIFIC | NP0323BOX | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| CTCF抗体 | Merck Millipore | 07-729 | |
| WAPL抗体 | Proteintech | 16370-1-AP | |
| ACTB抗体 | Abcam | ab8227 | |
| RAD21抗体 | Abcam | ab154769 | |
| HSP90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| H3K27me3抗体 | Diagenode | C15410195 | |
| Clarity Max ECL底物 | Biorad | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞周期分析 | Click-iT EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式分析 | BD LSRFortessa分析仪 | BD | -- |
| FlowJo 10.3软件 | -- | -- | |
| DamID | ISOLATE II基因组DNA提取试剂盒 | Bioline | BIO-52067 |
| pA-DamID | Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 |
| proteinA-Dam（pA-Dam）融合蛋白 | -- | -- | |
| Dam甲基转移酶 | NEB | M0222L | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | -- | -- |
| ChIP-seq | CTCF抗体 | Merck Millipore | 07-729 |
| H3K27me3抗体 | Diagenode | PAB-195-050 | |
| Protein G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| KAPA HTP文库制备试剂盒 | Roche | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TruSeq链特异性RNA LT试剂盒 | Illumina | -- | |
| 测序 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| Western blot | EGTA | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | mESC细胞系和培养基成分（DMEM/F12与Neurobasal 1:1，N-2、B-27、BSA、LIF、PD0325901、CHIR99021、1-硫代甘油），培养条件（0.1%明胶包被、每2天传代） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 蛋白耗竭 | IAA浓度（500μM）和处理时间（6h、24h、96h） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| pA-DamID | Lamin B1抗体浓度（1:400）、pA-Dam浓度（1:200）、Dam激活时间（30分钟）、SAM浓度（80μM）、基因组DNA提取方法 阅读提示：Methods: LaminB1 DamID and pA-DamID |
| Western blot | 抗体稀释度（CTCF 1:1000、WAPL 1:1000、ACTB 1:5000、RAD21 1:1000、HSP90 1:2000）、核提取和全细胞裂解缓冲液配方 阅读提示：Methods: Western blots |
| ChIP-seq | 抗体（CTCF 5μL、H3K27me3 5μL）、交联时间（10分钟）、染色质片段化长度（~300bp） 阅读提示：Methods: ChIP-seq |