鉴定CRC组织中的m3Es
绘制CRC样本中H3K4me3富集增强子的全基因组分布图谱。
对43对CRC肿瘤及癌旁组织进行H3K27ac和H3K4me3的ChIP-seq分析，鉴定出7438个m3Es，其中1689个为变异m3Es（1323个获得型，367个缺失型）。
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MLL1与Jun在结直肠癌增强子H3K4me3调控中的协同作用
Cooperation of MLL1 and Jun in controlling H3K4me3 on enhancers in colorectal cancer
实验完整度
高包含多层级证据：临床样本ChIP-seq、细胞系功能验证（CRISPR-KRAB、MLL1敲低）、动物模型（异种移植、AOM/DSS模型）及机制验证（Co-IP、ChIP-qPCR）。
主要模型
HCT116细胞系 RKO细胞系 BALB/C裸鼠异种移植模型 AOM/DSS诱导的C57BL/6J小鼠CRC模型
重点核对
43对CRC临床样本的ChIP-seq数据质量（排除4个样本） HCT116细胞中sgRNA靶向m3Es的敲低效果及靶基因表达变化 MLL1/KMT2A敲低对m3Es上H3K4me3水平的影响 JUN敲低对m3Es上H3K4me3和H3K27ac水平的影响 OICR-9429处理AOM/DSS小鼠模型的剂量与时间（5 mg/kg，每周三次，第3、6、9周）
摘要
增强子失调是癌细胞的重要特征之一。富含H3K4me3的增强子被认为在癌症中发挥重要作用。然而，其详细特征和调控机制尚未得到充分阐明。在本研究中，我们分析了43对结直肠癌（CRC）样本中H3K4me3富集增强子（m3Es）的图谱。m3Es在CRC中广泛分布，平均约占活性增强子总数的10%。我们在CRC中鉴定出1322个获得型变异m3Es（gain variant m3Es）和367个缺失型变异m3Es（lost variant m3Es）。获得型m3Es的靶基因富集于免疫应答通路。我们通过实验证明，抑制CBX8和RPS6KA5的m3Es可抑制CRC中靶基因的表达。此外，我们发现组蛋白甲基转移酶MLL1负责在所鉴定的变异m3Es上沉积H3K4me3。我们证明转录因子AP1/JUN与MLL1相互作用并调节m3E活性。应用MLL1活性小分子抑制剂OICR-9429可抑制所鉴定的变异m3Es的靶基因表达，增强抗肿瘤免疫，并在动物模型中抑制CRC生长。总之，我们的研究阐明了CRC中m3Es的全基因组图谱和调控机制，并揭示了潜在的癌症治疗新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌中H3K4me3富集增强子（m3Es）的分布特征及其调控机制是什么？
- 核心机制
- MLL1/KMT2A负责在m3Es上沉积H3K4me3，转录因子AP1/JUN与MLL1相互作用并协同调节m3E活性。
- 主要证据
- 通过43对CRC样本的ChIP-seq数据鉴定m3Es，并在HCT116细胞中验证了CBX8和RPS6KA5的m3Es功能；Co-IP实验证明JUN与MLL1相互作用。
- 研究意义
- 揭示了CRC中m3Es的全基因组图谱和调控机制，为癌症治疗提供了潜在新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证m3Es及其对靶基因表达的调控
验证m3Es在细胞系中的存在及其对近端基因表达的调控作用。
在HCT116和RKO细胞系中通过ChIP-qPCR验证9个基因的m3Es上的H3K4me3和H3K27ac富集，并使用CRISPR-KRAB系统抑制m3E活性，检测靶基因表达和组蛋白修饰变化。
评估m3Es对细胞功能和肿瘤生长的影响
探究m3Es对CRC细胞增殖、迁移和体内肿瘤生长的影响。
使用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移实验检测细胞增殖和迁移；将稳定表达m3E sgRNA的HCT116细胞注入裸鼠，观察肿瘤生长。
鉴定调控m3Es H3K4me3的甲基转移酶
确定负责m3Es上H3K4me3沉积的组蛋白甲基转移酶。
通过CRISPR/Cas9敲低7种主要H3K4甲基转移酶（KMT2A-E和SETD1A/B），检测m3E靶基因表达，发现MLL1/KMT2A敲低影响最大，并通过ChIP-qPCR验证H3K4me3水平下降。
验证小分子抑制剂对m3Es的调控
探究MLL1抑制剂OICR-9429和p300/CBP抑制剂C646对m3E活性及靶基因表达的影响。
用OICR-9429处理HCT116细胞，检测CBX8等靶基因表达和组蛋白修饰变化；用C646处理检测H3K27ac和H3K4me3的变化。
研究JUN转录因子对m3Es的调控
探究AP-1转录因子JUN在m3Es上的结合及其对组蛋白修饰的调控。
通过shRNA敲低JUN，检测靶基因表达和组蛋白修饰变化；构建FB-JUN稳定细胞系，通过Capture-ChIP检测JUN在m3Es上的富集；通过Co-IP验证JUN与MLL1的相互作用。
在AOM/DSS小鼠模型中分析JUN与m3Es的关联
探讨在AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中JUN与m3Es的关系。
利用AOM/DSS模型的ChIP-seq数据，分析不同时间点m3Es上Jun的结合情况，并与Jun表达水平相关联。
评估OICR-9429的抗肿瘤和免疫调节作用
探究OICR-9429在体内对CRC肿瘤生长和肿瘤免疫的影响。
在AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中用OICR-9429处理，检测肿瘤大小和数量，通过免疫荧光染色评估免疫细胞浸润（CD4+、CD8+、NK细胞、M2巨噬细胞）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ChIP实验 | H3K4me3抗体 | Millipore | 04-745 |
| H3K4me3抗体 | CST | 9751 | |
| H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 免疫印迹 | MLL1抗体 | CST | 14197 |
| JUN抗体 | CST | 9165 | |
| CBX8抗体 | ABclonal | A6222 | |
| CBX2抗体 | ABclonal | A3294 | |
| CBX4抗体 | ABclonal | A5109 | |
| RPS6KA5抗体 | ABclonal | A5699 | |
| CCND1抗体 | ABclonal | A19038 | |
| JAK3抗体 | ABclonal | A0748 | |
| KRT18抗体 | ABclonal | A19778 | |
| PTP4A3抗体 | ABclonal | A2004 | |
| SNAI1抗体 | ABclonal | A11794 | |
| TNFSF10抗体 | ABclonal | A2138 | |
| ACTB抗体 | ABclonal | AC038 | |
| GAPDH抗体 | ABclonal | AC033 | |
| 免疫组化 | CD3抗体 | Abcam | ab16669 |
| CD4抗体 | Abcam | ab183685 | |
| CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| F4/80抗体 | CST | 70076 | |
| CD206抗体 | Proteintech | 60143-1-Ig | |
| NKp46抗体 | Abcam | ab233558 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 动物实验 | 偶氮甲烷 | MP Biomedicals | 183971 |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 160110 | |
| 药物处理 | OICR-9429 | -- | -- |
| C646 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 基质胶 | R&D | -- | |
| 类器官培养 | Advanced DMEM/F12培养基 | GIBCO | -- |
| 谷氨酰胺补充剂 | GIBCO | -- | |
| HEPES缓冲液 | GIBCO | -- | |
| B-27补充剂 | GIBCO | -- | |
| N-2补充剂 | GIBCO | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | -- | |
| A8301 | Tocris | -- | |
| [Leu15]-胃泌素 | Sigma | -- | |
| Y-27632 | MCE | -- | |
| Noggin重组蛋白 | MCE | -- | |
| 表皮生长因子 | MCE | -- | |
| R-Spondin1重组蛋白 | MCE | -- | |
| SB202190 | MCE | -- | |
| CHIR99021 | MCE | -- | |
| Blebbistatin | MCE | -- | |
| 细胞回收液 | Corning | -- | |
| TrypLE表达酶 | Gibco | -- | |
| ChIP实验 | 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S |
| 蛋白G琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白酶K | Biosharp | -- | |
| DNA纯化试剂盒 | TIANGEN | DP214-03 | |
| Capture-ChIP | 链霉亲和素磁珠 | Thermo-Fisher Scientific | -- |
| SMCC交联剂 | MCE | -- | |
| RNA-seq | 超纯RNA提取试剂盒 | CWBIO | CW0581M |
| NEBNext poly(A) mRNA磁力分离模块 | NEB | E7490 | |
| NEBNext Ultra II非定向RNA第二链合成模块 | NEB | E6111 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| ChIP-seq | VATHS通用DNA文库制备试剂盒 | Vazyme | ND606 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | -- |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | MCE | -- |
| 核糖核酸酶 | Sigma | -- | |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | BD Biosciences | -- |
| 免疫印迹 | Clarity Western ECL底物 | BIO-RAD | -- |
| CRISPR | lentiCRISPRv2-puro载体 | Addgene | 98290 |
| pLH-spsgRNA2载体 | Addgene | 64114 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| Primocin抗生素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ChIP-seq分析 | 43对结直肠癌样本的配对信息、H3K27ac和H3K4me3抗体的批号、测序平台及数据分析参数 阅读提示：Methods: ChIP-seq data analysis |
| m3E验证 | HCT116和RKO细胞系的培养条件、ChIP-qPCR所用抗体及引物序列 阅读提示：Methods: ChIP assay, Validation of gain H3K4me3 enhancers |
| 功能验证 | sgRNA靶向序列、dCas9-KRAB-MeCP2载体、病毒包装和感染条件、细胞筛选药物浓度 阅读提示：Methods: CRISPR-Cas9-KRAB mediated repression, Figure 3 |
| 动物实验-异种移植 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞注射数量、肿瘤测量时间点 阅读提示：Methods: Xenograft experiments in mice |
| 动物实验-AOM/DSS模型 | AOM和DSS的剂量、处理时间、OICR-9429给药剂量和频率、小鼠体重监测 阅读提示：Methods: Generation of colitis-associated colorectal cancer mice model, Figure 7A |
| 药物处理 | OICR-9429浓度（10 µM）和处理时间（48小时），C646浓度（10 µM）和处理时间（12小时） 阅读提示：Figure 5H-M, Methods: Cell culture and drug treatment |