SMOOTH-seq方法建立
开发一种基于第三代测序平台的单细胞全基因组测序方法，以实现长片段DNA的扩增和测序。
测试不同转座缓冲液和DNA聚合酶，优化Tn5转座酶浓度和PCR循环数，确定最终反应条件（0.2ng Tn5转座酶，20个循环PCR，Tks酶），使用AMPure PB beads纯化后，在PacBio Sequel II系统上进行HiFi模式测序。
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SMOOTH-seq：基于第三代测序平台的人类细胞单细胞基因组测序
SMOOTH-seq: single-cell genome sequencing of human cells on a third-generation sequencing platform
实验完整度
高包含细胞系模型（K562）和患者样本（结直肠癌）两个独立证据层级，并包含功能验证（PCR验证SVs和ecDNAs）和机制验证（ecDNA结构解析）。
主要模型
K562细胞系 结直肠癌患者原代肿瘤细胞 HEK293T细胞系（作为PCR验证对照）
重点核对
K562细胞分两个克隆（clone 1和clone 2）培养，共91个单细胞用于SMOOTH-seq分析 结直肠癌患者样本经FACS分选CD235a-CD326+细胞，共96个单细胞进行SMOOTH-seq SMOOTH-seq使用0.2ng Tn5转座酶和20个循环PCR扩增单细胞基因组DNA SV检测时要求至少2个细胞支持，以降低假阳性率 SNV检测时使用GATK HaplotypeCaller，ploidy设为1，要求reads mapping quality ≥60
摘要
目前尚无有效方法在单细胞全基因组水平上检测结构变异（SVs）和染色体外环状DNA（ecDNAs）。在此，我们开发了一种基于第三代测序平台的单细胞全基因组测序（scWGS）新方法，命名为SMOOTH-seq（通过转座子插入扩增的长片段的单分子实时测序）。我们评估了该方法在人癌细胞系和结直肠癌样本中检测拷贝数变异（CNVs）、结构变异（SVs）和单核苷酸变异（SNVs）的性能，结果表明SMOOTH-seq能可靠有效地检测单个细胞中的SVs和ecDNAs，但在检测CNVs和SNVs方面准确性相对有限。SMOOTH-seq开启了scWGS的新篇章，因为它能产生千碱基长的高保真读数。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现单细胞全基因组水平上结构变异（SVs）和染色体外环状DNA（ecDNAs）的检测？
- 核心机制
- SMOOTH-seq利用Tn5转座酶低密度插入和单分子实时测序，产生长片段高保真读数，可直接跨越变异断点，从而检测SVs和ecDNAs。
- 主要证据
- 在K562细胞系和结直肠癌样本中，SMOOTH-seq检测到大量SVs和ecDNAs，并通过PCR和Sanger测序验证了部分插入、易位和ecDNA事件。
- 研究意义
- SMOOTH-seq为单细胞基因组学提供了新方法，尤其促进了单细胞SV和ecDNA检测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CNV检测
评估SMOOTH-seq在单个K562细胞中检测拷贝数变异（CNVs）的能力。
对两个K562克隆的91个单细胞进行SMOOTH-seq测序，将CCS reads比对到人类基因组（hg38），计算1Mb窗口内的reads比例，分析CNV模式，并与bulk NGS数据比较。
SV检测与验证
检测单个K562细胞中的结构变异（SVs），并通过PCR验证部分插入和易位事件。
使用pbsv调用SVs，要求至少2个细胞支持，分析不同类型SVs的精度和分布，选取部分插入和易位事件进行PCR验证，并以HEK293T细胞作为对照。
ecDNA检测与验证
评估SMOOTH-seq检测单个K562细胞中染色体外环状DNA（ecDNAs）的能力，并验证候选ecDNAs。
开发自定义流程检测ecDNAs，基于reads的嵌合比对和长度一致性，过滤与串联重复和重复事件重叠的reads，最终整合所有K562细胞的候选ecDNAs，要求至少2个细胞支持。通过PCR和Sanger测序验证部分ecDNA候选。
SNV检测
评估SMOOTH-seq在单个K562细胞中检测单核苷酸变异（SNVs）的能力。
使用GATK HaplotypeCaller调用SNVs，以bulk NGS数据作为参照，计算假阳性率和精度，并分析不同细胞支持数下的检测效率。
结直肠癌样本SV检测
评估SMOOTH-seq在体内肿瘤细胞中检测结构变异（SVs）的能力。
从结直肠癌患者样本中分选单个肿瘤细胞，进行SMOOTH-seq测序，要求至少5%基因组覆盖度，最终保留44个细胞，调用SVs并筛选CRC特异性SVs，通过PCR验证部分插入事件。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Gibco | -- |
| 高糖DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- |
| DNA定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 建库 | KAPA Hyper Prep试剂盒 | KAPA | -- |
| 测序 | HiSeq-4000测序仪 | Illumina | -- |
| DNA片段化 | Covaris S220超声波破碎仪 | Covaris | -- |
| 单细胞裂解 | Tris-EDTA缓冲液 | -- | -- |
| Qiagen蛋白酶 | Qiagen | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| SMOOTH-seq文库构建 | TAPS_PEG8K缓冲液 | -- | -- |
| Tn5转座酶 | Vazyme | S601-01 | |
| Tks Gflex DNA聚合酶 | TAKARA | R060B | |
| Ampure PB磁珠 | Pacific Biosciences | 100-265-900 | |
| SMRTbell模板制备试剂盒v1.0-SPv3 | Pacific Biosciences | 100-991-900 | |
| 单细胞制备 | II型胶原酶 | Gibco | 17101015 |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 | |
| 流式分选 | APC标记抗人CD326 (EpCAM)抗体 | BioLegend | 369810 |
| PE标记抗人CD235a (Glycophorin A)抗体 | BioLegend | 349106 | |
| 7-AAD活力染色液 | BioLegend | 420404 | |
| PCR验证 | 2×Taq PCR预混液 | TIANGEN | KT201 |
| 琼脂糖凝胶电泳 | 琼脂糖 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | K562细胞培养于RPMI1640培养基（10% FBS，1×l-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素）；HEK293T细胞培养于DMEM/高糖培养基（10% FBS，1×l-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素）。 阅读提示：Methods: Culture of K562 and human HEK293T cells |
| SMOOTH-seq文库构建 | 单细胞裂解条件（50°C 3小时，70°C 30分钟）；转座反应条件（0.2ng Tn5转座酶，55°C 10分钟）；PCR扩增条件（Tks Gflex DNA聚合酶，20个循环）；纯化使用0.4体积AMPure PB磁珠。 阅读提示：Methods: SMOOTH-seq library preparation of single cells |
| 测序 | PacBio Sequel II系统，HiFi模式；CCS read生成参数（ccs v4.0.0，--minPasses 1）；比对参数（pbmm2 v1.1.0，--preset CCS）。 阅读提示：Methods: CCS reads generation and mapping |
| CNV分析 | 窗口大小1Mb；K562 ploidy设为3；CV计算以bulk K562拷贝数为基线。 阅读提示：Methods: CNV analysis |
| SV检测 | SV调用工具pbsv v2.2.2；过滤条件（至少2个细胞支持，过滤IMPRECISE和SHADOWED）；基准为bulk TGS数据（至少4个reads支持，reads比例>15%）。 阅读提示：Methods: SV detection and benchmarking |
| SNV检测 | GATK HaplotypeCaller v4.1.4.0参数（--ploidy 1，--minimum-mapping-quality 60）；过滤条件QD < 2.0；基准为bulk NGS数据。 阅读提示：Methods: SNV detection and benchmarking |
| ecDNA检测 | 自定义流程；过滤与tandem repeats (>1kb)和4细胞支持的duplications重叠的reads；整合时要求至少2个细胞支持。 阅读提示：Methods: ecDNA detection |
| 结直肠癌样本处理 | 患者样本经1.5 mg/mL胶原酶II和IV消化30分钟；FACS分选CD235a-CD326+细胞；单细胞经口吸管挑取。 阅读提示：Methods: Patient sample 和 Single-cell preparation |