细胞培养和RNA提取
获得足量、高质量的RNA用于文库构建。
培养SH-SY5Y、BT549和T47D细胞，提取总RNA，并添加SIRV-Set 4作为spike-in对照。
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评估纳米孔自适应采样在靶向转录组测序中的潜力与局限性
Evaluating the potential and limitations of nanopore adaptive sampling for targeted transcriptome sequencing
实验完整度
高包含多种细胞系（SH-SY5Y、BT549、T47D）的体外实验，多种测序方法（cDNA、dRNA、TEQUILA-seq）和多种参考FASTA结构的比较，并进行读长、质量、富集效率、转录本定量和新型转录本检测等全面评估。
主要模型
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系 BT549人乳腺癌细胞系 T47D人乳腺癌细胞系
重点核对
细胞系的选择（SH-SY5Y、BT549、T47D）及培养条件 cDNA文库制备的起始RNA量（300 ng）及SIRV-Set 4添加比例（1:1200） 直接RNA文库制备的总RNA量（3600 ng）及SIRV添加量（3 ng） cDNA文库载荷量（20或40 fmol） 目标基因面板（221个剪接因子或468个可操作癌症基因）
摘要
长读长RNA测序是转录组学的一项强大技术，但低通量和高成本构成挑战。自适应采样是Oxford Nanopore Technologies的一项功能，通过选择性弹出非靶分子实现实时富集。我们评估了自适应采样在人类转录组分析中的应用。自适应采样适度富集靶转录本（cDNA测序1.3倍，直接RNA测序1.9倍），同时保留基因表达和剪接谱，但效果明显低于cDNA杂交捕获。读长短和测序质量低限制了性能。直接RNA测序的自适应采样可在固定运行时间内提高靶标产量（约20%），可能有助于时间受限的应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估牛津纳米孔技术的自适应采样功能在人类转录组靶向测序中的性能和局限性。
- 核心机制
- 自适应采样的富集效率受参考FASTA文件结构、读长和测序质量的影响。较短的读长导致非靶标读段在拒绝决定前被完全测序，而低质量的靶标读段可能被错误拒绝。
- 主要证据
- 通过在不同细胞系、不同目标面板和不同参考FASTA结构下进行cDNA和直接RNA的自适应采样实验，并与TEQUILA-seq杂交捕获方法比较，发现cDNA-AS富集1.3-1.34倍，dRNA-AS富集1.90倍，而TEQUILA-seq富集36.7倍。
- 研究意义
- 该研究提供了对ONT自适应采样在复杂转录组中靶向富集能力的全面评估，表明其当前并非最优的富集策略，但直接RNA自适应采样可能适用于时间敏感的临床应用，且无需额外样品处理。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
cDNA文库构建和直接RNA文库构建
为测序构建标准的cDNA和直接RNA文库。
对cDNA文库，使用Maxima H逆转录酶从总RNA合成cDNA，并进行PCR扩增。对直接RNA文库，按照SQK-RNA004协议从总RNA制备。
自适应采样测序
评估不同参考FASTA结构下cDNA和直接RNA测序的自适应采样富集效果。
在PromethION或P2 Solo上使用不同参考FASTA文件（基因、主转录本、转录本、外显子）进行自适应采样，并与标准全转录组测序和TEQUILA-seq比较。部分实验采用半流动槽的split-format设计。
测序数据分析
评估富集效果、读长、质量分数和转录本定量。
使用dorado进行碱基识别，minimap2比对，提取读长和质量分数，计算富集倍数，并利用ESPRESSO进行转录本鉴定和定量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 11330032 |
| 胎牛血清 | Corning | MT35010CV | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 人胰岛素 | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| 牛胰岛素 | Cell Applications | 128100 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| SIRV-Set 4标准品 | Lexogen | 141.01 | |
| cDNA合成 | Maxima H minus逆转录酶 | Thermo Fisher | EP0752 |
| dNTP | Invitrogen | 18427088 | |
| 模板转换寡核苷酸(TSO) | IDT | -- | |
| RNase抑制剂 | Promega | N2615 | |
| PCR扩增 | KAPA HiFi HotStart预混液 | Fisher Scientific | 50-196-5217 |
| cDNA纯化 | SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 |
| 直接RNA文库构建 | T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 |
| 快速连接反应缓冲液 | NEB | B6058 | |
| RNA酶抑制剂 | Invitrogen | 10777019 | |
| dNTP混合液 | Thermo Scientific | 18427013 | |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080093 | |
| Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| cDNA文库构建 | NEBNext Ultra II末端修复/dA加尾模块 | NEB | E7546 |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| NEBNext快速T4 DNA连接酶 | NEB | E6056 | |
| 测序平台 | P2 Solo测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| P24测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| GridION测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| 测序流动槽 | RNA PromethION流动槽 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-PRO004RA |
| PromethION流动槽 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-PRO114M | |
| R9.4.1流动槽 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 | |
| 流动槽清洗 | 流动槽清洗试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| Agilent 4200 TapeStation | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（SH-SY5Y、BT549、T47D）及培养条件：培养基、血清、抗生素、胰岛素等 阅读提示：Methods: Cell culture |
| RNA提取与SIRV添加 | 总RNA提取方法（TRIzol）、SIRV-Set 4的添加比例（1:1200） 阅读提示：Methods: RNA extraction, cDNA synthesis, and TEQUILA-seq |
| cDNA文库构建 | 起始RNA量（300 ng）、逆转录酶、PCR循环数（12） 阅读提示：Methods: RNA extraction, cDNA synthesis, and TEQUILA-seq |
| 直接RNA文库构建 | 总RNA量（3600 ng）、SIRV量（3 ng）、使用的试剂盒（SQK-RNA004） 阅读提示：Methods: Nanopore library construction and sequencing |
| 测序与自适应采样 | 流动槽类型、测序仪、cDNA文库载荷量（20或40 fmol）、直接RNA载荷量（3 µg）、自适应采样通道设置（1-1500）、目标面板 阅读提示：Methods: Nanopore library construction and sequencing; Construction of reference FASTA files for adaptive sampling |