合成致死CRISPR筛选
鉴定与HMGCR或LDLR存在合成致死相互作用的基因，以发现胆固醇稳态的关键调控因子。
在HepG2细胞中使用洛伐他汀抑制HMGCR进行全基因组CRISPR敲除筛选（Screen 1）；在HeLa细胞中重复Screen 2；在LDLR敲除的单克隆HeLa细胞中进行Screen 3。通过MAGeCK算法计算β分数或tRRA分数，以确定合成致死或负遗传相互作用hit。
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系统性解析胆固醇和脂质稳态相关的功能基因
Systematic interrogation of functional genes underlying cholesterol and lipid homeostasis
实验完整度
高研究包含CRISPR筛选、RNA-seq、蛋白质组学、代谢组学及人类遗传关联分析等多层次证据，并通过细胞功能实验和基因敲除小鼠模型进行了功能与机制验证。
主要模型
HepG2细胞 HeLa细胞 GGT7基因敲除小鼠
重点核对
HepG2和HeLa细胞中LDLR或HMGCR的CRISPR敲除 洛伐他汀处理浓度：HepG2为0.3 μM，HeLa为0.2 μM 高脂高胆固醇饮食（含1.25%胆固醇、15%脂肪、0.5%胆酸）饲喂小鼠30周 GGT7或MYH10敲除后检测细胞总胆固醇水平 通过免疫沉淀结合质谱鉴定GGT7相互作用蛋白MYH10
摘要
背景：血脂异常或高胆固醇血症是心血管疾病的主要危险因素之一。阐明脂质或胆固醇稳态的分子基础将有助于发现新的药物靶点并开发有效的治疗方法。结果：在这里，我们采用系统性方法，通过联合使用高通量CRISPR筛选、RNA测序、人类遗传变异关联分析以及蛋白质组学和代谢组学分析，来编目脂质和胆固醇稳态相关的基因。这种整合的多组学方法确定了γ-谷氨酰转移酶GGT7作为一个有趣的潜在胆固醇和脂质调节因子。作为SREBP2依赖性靶标，GGT7正调控细胞胆固醇水平，并影响多个胆固醇代谢基因的表达。此外，GGT7与肌动蛋白依赖性运动蛋白MYH10相互作用，控制低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）进入细胞。在小鼠中基因敲除Ggt7导致血清胆固醇水平降低，支持Ggt7在胆固醇稳态中的体内作用。结论：我们的研究不仅从多个角度提供了脂质或胆固醇调节基因的库，还揭示了γ-谷氨酰转移酶与胆固醇代谢之间的因果联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些未知基因参与调控胆固醇和脂质稳态，它们的作用机制是什么？
- 核心机制
- GGT7作为SREBP2依赖性靶标，通过与肌动蛋白依赖性运动蛋白MYH10相互作用，调节LDL-C的细胞摄取，从而正向调控细胞胆固醇水平。
- 主要证据
- 通过整合CRISPR筛选、RNA测序和蛋白质组学分析，发现GGT7在胆固醇缺乏时上调；功能实验显示敲除GGT7或MYH10均降低细胞胆固醇和Dil-LDL摄取；小鼠敲除Ggt7降低血清胆固醇水平。
- 研究意义
- 该研究首次从基础生物学角度证明GGT酶直接参与胆固醇水平控制，提示γ-谷氨酰转移酶可作为心血管疾病的诊断生物标志物和潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
识别响应胆固醇水平变化或受SREBP2调控的潜在胆固醇调节基因。
对LDLR KO、HMGCR KO或双敲除（DKO）的HepG2和HeLa细胞进行RNA-seq；并对HepG2细胞在固醇缺乏条件下（添加10 μM洛伐他汀无血清）及SREBF2 KO细胞进行转录组比较。
蛋白质组分析
鉴定在胆固醇缺乏时差异表达的蛋白质，尤其是上调的蛋白。
对LDLR/HMGCR DKO HepG2细胞与对照细胞进行基于质谱的蛋白质组学分析。
整合分析确定候选基因
整合多组学数据及人类遗传分析，筛选最有可能是胆固醇调节因子的基因。
整合CRISPR筛选、RNA-seq、蛋白质组学数据以及人类遗传关联分析（基于GWAS数据库和文献）结果，通过维恩图找出交集基因，确定GGT7为候选基因。
GGT7功能验证
验证GGT7对细胞胆固醇和脂质水平的影响。
在HepG2细胞中使用两个独立sgRNA敲除GGT7，检测细胞总胆固醇水平和代谢组变化。
机制研究
阐明GGT7调控胆固醇代谢的分子机制。
通过免疫沉淀结合质谱鉴定GGT7相互作用蛋白，发现MYH10；验证内源相互作用；敲除MYH10检测细胞胆固醇和Dil-LDL摄取。
体内验证
评估Ggt7在小鼠胆固醇和脂质稳态中的体内功能。
构建全身Ggt7敲除小鼠，给予正常饮食或高脂高胆固醇饮食（HFHC）30周，检测体重、血清和组织的脂质水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Notacor | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 洛伐他汀 | MedChem Express | HY-N0504 |
| 基因敲除 | pLentiCRISPRv2-Puro载体 | Addgene | 52961 |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 |
| X-tremeGENE转染试剂 | -- | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Hanbio | HB-CCK-8-5 |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒大提试剂盒 | TianGen | DP117 |
| CRISPR文库 | 人H3 CRISPR敲除文库 | Addgene | 133914 |
| RNA提取 | UNIQ-10 Trizol总RNA提取试剂盒 | Sangon | B511321 |
| 逆转录 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| qPCR | SYBR荧光定量试剂 | Cwbio | CW0957H |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Meilunbio | MA0082 |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Pall | C05-05002 |
| 抗HMGCR抗体 | Abcam | ab174830 | |
| 抗LDLR抗体 | Proteintech | 10785-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| 抗GGT7抗体 | Proteintech | 24674-1-AP | |
| 抗MYH10抗体 | Proteintech | 19673-1-AP | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG磁珠 | Thermo Fisher Scientific | A36797 |
| 3xFLAG肽 | Sangon | T510060-0005 | |
| Protein G琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| 组织学分析 | 油红O染色 | -- | -- |
| 血液生化检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| γ-谷氨酰转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C017-2-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 细胞系（HepG2/HeLa）、MOI、覆盖度、筛选时间、筛选标准 阅读提示：Methods: Genome-wide CRISPR screening |
| 细胞培养和药物处理 | 培养基、血清浓度、洛伐他汀处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell line models, Cell growth and viability assay |
| 转录组分析 | 样本类型、基因敲除类型、Sterol deprivation条件、SREBF2 KO、RNA-seq文库制备方法、差异表达阈值 阅读提示：Methods: RNA-seq analysis |
| 蛋白质组分析 | 细胞处理、裂解缓冲液、质谱仪器、差异蛋白阈值 阅读提示：Methods: Proteomics analysis |
| 动物实验 | 小鼠品系、基因敲除策略、饮食类型（ND/HFHC）、饲喂周期、样本量、检测指标 阅读提示：Methods: Mouse models, Blood and tissue sample analysis |