开发sim和call工作流程
模拟低频变异并实现高精度变异调用
开发了sim工作流模拟VCF中的变异到BAM比对文件中，并开发了call工作流进行变异检测和定量。
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satmut_utils：用于变异效应多重分析的模拟与变异调用软件包
satmut_utils: a simulation and variant calling package for multiplexed assays of variant effect
实验完整度
高包含软件开发生物信息学分析、模拟基准测试、机器学习错误校正、细胞实验和两种正交文库制备方法的验证。
主要模型
HEK293T LLP iCasp9 Blast细胞系 CBS变异文库 酵母功能互补数据
重点核对
模拟数据集中变异的真实频率和数量 比较软件的分析参数和预处理步骤 机器学习模型的训练和验证数据集 CBS变异文库的克隆和稳定表达条件 RNA提取、cDNA合成和文库制备方法
摘要
编码序列中数百万个个体遗传变异对分子表型的影响仍然未知。变异效应多重分析（MAVEs）是可扩展的注释相关变异的方法，但现有软件缺乏标准化、配置繁琐，并且无法扩展到大型靶标。我们提出satmut_utils作为模拟和变异定量的灵活解决方案。然后，我们使用模拟和真实的MAVE数据对MAVE软件进行基准测试。最后，我们使用两种实验方法测定了数千个胱硫醚β-合酶变体的mRNA丰度。satmut_utils软件包能够实现MAVE的高性能分析，并揭示变异改变mRNA丰度的能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何标准化和扩展MAVE数据的变异调用，并探究CBS变异对mRNA丰度的影响？
- 核心机制
- 部分变异通过改变密码子最优性影响mRNA稳定性，从而导致mRNA丰度变化。
- 主要证据
- 使用satmut_utils分析模拟和真实MAVE数据，并通过两种正交文库制备方法在HEK293T细胞中测定CBS变体的mRNA丰度。
- 研究意义
- satmut_utils为MAVE分析提供了灵活解决方案，并有助于解释变异对基因表达多层面的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模拟基准测试
比较satmut_utils与现有MAVE变异调用器的性能
在CBS单扩增子中模拟281个变异，比较satmut_utils与dms_tools2、Enrich2和DiMSum的灵敏度和精确度。
机器学习误差校正
利用模拟数据训练模型以降低假阳性
从四个sim数据集提取质量特征，训练随机森林等分类器，评估模型性能和跨平台泛化能力。
读段预处理
减少由引物合成错误和PCR重复引起的假阳性
实现引物碱基质量屏蔽和基于UMI的共识去重，并评估其对变异调用精度的影响。
真实MAVE数据端到端分析
评估satmut_utils对生长选择型MAVE数据的适用性
使用satmut_utils和DiMSum分析SUMO1和HA数据集，比较变异计数和适应度估计。
CBS变异文库的构建与表达
在人类细胞中稳定表达CBS变异文库
将CBS变异文库重组到HEK293T着陆垫细胞系，诱导表达后提取gDNA和RNA。
两种文库制备方法的变异检测
通过正交方法验证变异检测的可重复性
使用扩增子和RACE-like两种方法制备文库，进行测序并比较变异频率估计。
差异丰度分析
鉴定影响mRNA丰度的CBS变异
比较cDNA和gDNA中变异频率，使用limma-trend鉴定差异丰度变异，并分析与CSC、tRNA丰度及酵母功能互补数据的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
机器学习误差校正
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995065 |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D3072 | |
| 杀稻瘟菌素 | Gibco | A1113903 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 |
| 细胞处理 | AP1903 | MedChemExpress | HY-16046 |
| 克隆 | Gateway LR II反应 | Thermo Fisher Scientific | 11-791-020 |
| Endura电转感受态细胞 | Lucigen | 60242 | |
| 质粒提取 | ZymoPURE II质粒大提试剂盒 | Zymo Research | D4203 |
| gDNA提取 | 细胞和组织DNA分离试剂盒 | Norgen Biotek Corp | 24700 |
| RNA提取 | QIAzol裂解液 | Qiagen | 79306 |
| 氯仿 | -- | -- | |
| Phase-Lock Gel heavy管 | QuantaBio | 2302830 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| RNA处理 | DNaseI | NEB | M0303 |
| RNA纯化 | RNA清洁和浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1015 |
| RNA质量评估 | Bioanalyzer真核RNA Pico试剂盒 | Agilent | 5067-1513 |
| cDNA合成 | SuperScript IV逆转录酶 | Thermo Fisher | 18090010 |
| SUPERase-In RNase抑制剂 | Thermo Fisher | AM2696 | |
| RNaseH | NEB | M0297 | |
| PCR | Q5聚合酶 | NEB | M0491 |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina双索引引物组1 | NEB | E7600S | |
| 凝胶提取 | Nucleospin凝胶和PCR纯化试剂盒 | Takara | 740609 |
| 文库制备 | ArcherDX LiquidPlex文库制备试剂盒 | ArcherDX | -- |
| DNA片段化 | Covaris S2超声仪 | Covaris | -- |
| 文库定量 | KAPA文库定量试剂盒（Illumina） | Roche | KK4873 |
| 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| Qubit高灵敏度DNA检测 | Thermo Fisher | Q32851 | |
| qPCR | Applied Biosystems ViiA 7实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| 文库大小选择 | BluePippin 2%胶 | Sage Bioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CBS文库构建与表达 | HEK293T LLP iCasp9 Blast细胞系、CBS变异文库、转染试剂剂量、多西环素浓度和诱导时间 阅读提示：Methods: Cell culture, CBS library cloning, Stable expression of CBS variant library |
| RNA和cDNA制备 | RNA提取试剂、DNase处理、逆转录酶和引物 阅读提示：Methods: RNA extraction and cDNA synthesis |
| 扩增子文库制备 | PCR循环数、引物序列、聚合酶类型 阅读提示：Methods: Amplicon library preparation |
| RACE-like文库制备 | ArcherDX试剂盒、CBS引物、DNA片段化参数 阅读提示：Methods: RACE-like library preparation |
| 测序 | 测序平台、读长、PhiX比例 阅读提示：Methods: Next-generation sequencing |
| 差异丰度分析 | 变异过滤条件、统计模型、FDR阈值 阅读提示：Methods: Differential abundance analysis |