cfDNA释放动力学表征
确定培养上清中cfDNA是否可检测，以及其浓度和片段大小随时间的变化。
培养小鼠ESC系，洗涤后在不同时间点收集培养基，离心去除碎片，分离cfDNA，定量并分析片段大小。
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基于细胞游离DNA甲基化的体外细胞状态无扰动监测
Non-disruptive in vitro monitoring of cellular states with cell-free DNA methylation
实验完整度
高包含体外细胞模型（小鼠ESC、人iPSC）中的药物处理和分化实验，并通过WGBS和ONT测序进行验证，涉及多个时间点和生物学重复。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（KH2、F1G4、V6.5） 人诱导多能干细胞（FSPS13B）来源的3D生物反应器肝细胞
重点核对
小鼠ESC培养时，每次洗涤后1-24小时收集cfDNA的量（3-41 ng at 1 h，61-192 ng at 24 h） DNMT1抑制剂GSK-3484862处理浓度2.5 µM，处理4天，恢复2天 cfDNA释放时间标准化：收集前1小时洗涤细胞 纳米孔测序：每文库约2X基因组覆盖度，从样品收集到数据生成的周转时间为380分钟 肝细胞分化时间点：第0、10、20天收集cfDNA和gDNA
摘要
单个CpG甲基化特征刻画了每种哺乳动物细胞类型，从而为临床和诊断应用提供了强大的读数。在这里，我们将这一原理应用于体外细胞系统，利用释放到培养基中的细胞游离DNA来追踪小分子处理和基于生物反应器的定向分化过程中的表观基因组反应。结合牛津纳米孔测序，我们的方法能够快速评估全局CpG甲基化动态和增强子状态。该策略提供了一种简化方法，可随时应用和定制，用于对各种体外筛选模式进行无扰动监测。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用培养上清中的cfDNA甲基化实现体外细胞状态的非侵入式监测？
- 核心机制
- 细胞死亡释放的核小体片段cfDNA保留来源细胞的CpG甲基化标记，因此培养基中的cfDNA甲基化谱可反映细胞状态的动态变化。
- 主要证据
- 在小鼠ESC中，cfDNA和匹配的gDNA在1kb tile水平上甲基化相关性高（R=0.95-0.85），并共同反映DNMT1抑制剂引起的全局去甲基化和恢复。在3D生物反应器肝细胞分化中，cfDNA和gDNA均显示肝细胞增强子区域逐步去甲基化。
- 研究意义
- 该策略提供了一种非破坏性的高时间分辨率监测方法，可应用于多种体外模型，为基础研究和转化应用提供广泛潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DNMT1抑制剂处理下的甲基化动态监测
评估cfDNA甲基化是否能准确反映药物诱导的全局甲基化变化。
使用DNMT1抑制剂GSK-3484862处理KH2细胞4天，随后恢复2天，在多个时间点收集cfDNA和匹配gDNA，进行WGBS测序并比较甲基化谱。
3D生物反应器肝细胞分化中的cfDNA监测
在更复杂的3D分化体系中验证cfDNA甲基化监测的可行性，并评估快速流程。
将人iPSC在3D生物反应器中定向分化为肝细胞，在第0、10、20天收集cfDNA和gDNA，使用纳米孔测序分析甲基化，并检查肝细胞增强子去甲基化状态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | TrypLE | Gibco | 12604021 |
| 敲除DMEM培养基 | Gibco | 10829018 | |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 谷氨酰胺 | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 白血病抑制因子 | -- | -- | |
| 3D肝细胞分化 | 3D生物反应器 | ReproCell ABLE Biott | ABBWVS03A-6 |
| cfDNA收集和分离 | 蛋白酶K | InnuScreen GmbH | 845-CH-0010006 |
| DNA清洁和浓缩试剂盒 | Zymo | D4004 | |
| gDNA提取 | PureLink基因组DNA试剂盒 | Invitrogen | K182001 |
| DNA定量和片段分析 | Qubit HS dsDNA/ssDNA检测 | Invitrogen | 10616763 |
| Qubit4荧光计 | Invitrogen | 16223001 | |
| 高灵敏度D5000和基因组DNA ScreenTapes | Agilent | 5067-5592/3 and 5067-5365/6 | |
| TapeStation 4150系统 | Agilent | G2992AA | |
| DNMT1抑制剂处理 | DNMT1抑制剂GSK-3484862 | MedChem | HY-135146 |
| 凋亡诱导 | 星形孢菌素 | Sigma-Aldrich | 569396 |
| 凋亡检测 | AnnexinV偶联物 | Invitrogen | A23204 |
| FACSAria II或Celesta | Beckton Dickinson | -- | |
| 核酸酶抑制 | EDTA | Invitrogen | 15575020 |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher | #62249 |
| 白蛋白抗体 | Bethyl Laboratories | A80-229A | |
| 二抗 | Invitrogen | -- | |
| CellDiscoverer7-LSM 900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| WGBS | Covaris S2系统 | -- | -- |
| DNA清洁和浓缩-5试剂盒 | Zymo | D4004 | |
| EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo | D5005 | |
| xGen™甲基化测序DNA文库制备试剂盒 | IDT | 10009824 | |
| xGEN UDI引物板2, 8nt | IDT | 10009816 | |
| Illumina NovaSeq 6000系统 | Illumina | -- | |
| ONT测序 | native barcoding kit 24 V14 | Oxford Nanopore | SQK-NBD114.24 |
| FLO-PRO114M流槽 | Oxford Nanopore | -- | |
| Megaruptor3 | Diagenode | B06010003 | |
| native barcoding kit 96 V14 | Oxford Nanopore | SQK-NBD114.96 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| cfDNA收集和分离 | 培养基体积、离心条件（300×g，3分钟）、蛋白酶K处理（8.3 µl/100 µl培养基）、DNA Clean & Concentrator Kit纯化比例（1:5） 阅读提示：Methods: cfDNA collection, isolation and quantification |
| DNMT1抑制剂处理 | GSK-3484862浓度（2.5 µM）、处理时间（4天）、恢复时间（2天）、对照（DMSO）、洗涤时间（收集前1小时） 阅读提示：Methods: DNMT1-Inhibitor treatment |
| 3D肝细胞分化 | 分化方案（参考文献[22]）、3D生物反应器型号、Doxycyclin去除时间（第10天）、采样时间点（0、10、20天） 阅读提示：Methods: Human 3D forward programming bioreactor hepatocytes |
| 纳米孔测序 | 文库制备试剂盒（SQK-NBD114.24、SQK-NBD114.96）、测序平台（PromethION）、流槽（FLO-PRO114M）、覆盖度（约2X） 阅读提示：Methods: ONT-SFM sequencing |
| WGBS测序 | 建库试剂盒（xGen Methyl-Seq DNA Library Prep Kit）、PCR循环数（8）、测序平台（NovaSeq 6000）、测序读长（150bp双端） 阅读提示：Methods: Whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) of cfDNA |