Pol I/II/III的急性耗竭系统建立
快速、特异地降解Pol I、Pol II或Pol III，以研究其交叉调控。
在mESCs中利用生长素诱导降解系统构建了Pol I (RPA1)、Pol II (RPB1) CTD和NTD、Pol III (RPC1)及RPAC1的degron细胞系。通过加入IAA 1小时实现急性耗竭，并通过Western blot和PRO-Seq验证了靶标聚合酶的特异性降解和转录抑制。
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RNA聚合酶的交叉调控谱分析强调聚合酶III通过维持局部染色质结构对mRNA转录的调控作用
Cross-regulome profiling of RNA polymerases highlights the regulatory role of polymerase III on mRNA transcription by maintaining local chromatin architecture
实验完整度
高包含多个独立证据层级：体外细胞系中利用生长素诱导降解系统急性耗竭Pol I/II/III，结合ChIP-Seq、PRO-Seq、ATAC-Seq、ChAR-Seq、EU-Seq、ChIP-MS等多种组学方法，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESCs）V6.5 Pol II CTD-degron mESCs Pol II NTD-degron mESCs Pol I degron mESCs Pol III degron mESCs RPAC1 degron mESCs
重点核对
生长素诱导降解系统：Pol I、Pol II、Pol III和RPAC1的degron细胞系，使用500 μM IAA处理1小时实现急性耗竭 Pol II CTD和NTD degron均能有效抑制Pol II转录，后续实验使用CTD degron Pol III耗竭导致FACT复合物（SSRP1）在染色质结合降低，且时间早于Pol II结合变化 DRB转录抑制释放实验用于测量Pol II转录速率 FACT敲低后的NET-Seq数据（GSE90906）重分析显示基因体区Pol II信号增加，与Pol III耗竭表型一致
摘要
背景：哺乳动物细胞有三种RNA聚合酶（Pols），Pol I、Pol II和Pol III。然而，这些聚合酶之间的交叉调控程度及其潜在机制仍不清楚。结果：我们利用急性耗竭Pol I、Pol II或Pol III后的全基因组分析来评估这些聚合酶之间的交叉调控效应。我们发现这些酶主要影响其自身靶基因的转录，而某些基因则由其他聚合酶转录。重要的是，交叉调控最活跃的类型以Pol III耗竭影响Pol II转录为例。Pol III耗竭后转录发生变化的Pol II基因富集于多种细胞功能，并且Pol III结合位点位于其启动子附近。然而，这些Pol III结合位点并不对应转移RNA。此外，我们证明Pol III调节Pol II转录和促进染色质转录（FACT）复合物的染色质结合，以改变局部染色质结构，进而影响Pol II转录速率。结论：我们的结果支持一个模型，即RNA聚合酶显示出交叉调控效应：Pol III影响局部染色质结构和FACT-Pol II轴，以调节某些基因位点的Pol II转录速率。这项研究为理解Pol III在受发育疾病影响的各种组织中的失调提供了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物细胞中Pol I、Pol II和Pol III之间的交叉调控程度及机制尚不清楚。
- 核心机制
- Pol III通过调节局部染色质结构和FACT复合物的招募，影响Pol II转录速率，从而调控邻近mRNA基因的转录。
- 主要证据
- 急性耗竭Pol III后，ChIP-Seq和PRO-Seq显示Pol II在基因体区域的信号增加，启动子近端暂停减少；ATAC-Seq显示核小体占据增加、染色质可及性降低；Pol II ChIP-MS显示FACT复合物（SSRP1和SPT16）与Pol II的相互作用减少；时间序列ChIP-qPCR显示FACT结合变化早于Pol II变化；DRB释放实验显示Pol II转录速率减慢。
- 研究意义
- 该研究为理解Pol III在多种组织发育疾病中的失调提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Pol I/II/III的基因组定位分析
确定三种聚合酶在基因组上的结合位点及其关联。
对未处理的野生型mESCs进行Pol I、Pol II和Pol III的ChIP-Seq，鉴定结合峰，并进行聚类和重叠分析。
交叉调控的全局分析
系统性鉴定Pol I、Pol II或Pol III耗竭对其他聚合酶在染色质结合和新生转录上的影响。
在Pol I、Pol II或Pol III单独耗竭1小时后，对另外两种Pol进行ChIP-Seq和PRO-Seq，进行差异分析，识别显著的结合和转录变化。
Pol III对Pol II转录的影响机制研究
揭示Pol III调控Pol II转录的分子机制。
在Pol III耗竭后，进行Pol II ChIP-Seq、PRO-Seq、ATAC-Seq、ChAR-Seq、EU-Seq，分析了Pol II在启动子和基因体的信号变化、染色质可及性、核小体定位和新生转录速率。
Pol III对Pol II相互作用组的影响
鉴定Pol III耗竭后Pol II相互作用蛋白的变化，寻找候选调控因子。
通过Pol II ChIP-MS（DDA和DIA两种模式）鉴定Pol III耗竭后与Pol II相互作用增强或减弱的蛋白，并用Western blot验证FACT复合物等的变化。
验证FACT复合物在Pol III调控Pol II中的作用
验证FACT复合物是否介导Pol III对Pol II转录的调控。
在Pol III耗竭后，进行SSRP1 ChIP-Seq和ChIP-qPCR，检测FACT复合物的染色质结合变化；进行时间序列分析以确定FACT结合变化与Pol II结合变化的先后顺序；并进行恢复实验。
Pol II转录速率的评估
直接测量Pol III耗竭对Pol II转录速率的影响。
使用DRB转录抑制释放实验，结合Pol II和S2P Pol II ChIP-qPCR，测量长活跃基因Nipbl和Mycbp2的转录恢复速率。
长期耗竭Pol III的转录组变化分析
评估长期Pol III耗竭对基因表达的持续影响。
在Pol III耗竭0、24、48、96小时后进行polyA RNA-Seq，分析随时间变化的基因表达模式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证染色质结构和功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 吲哚-3-乙酸钠盐 | Sigma-Aldrich | 1I5148 | |
| FuGENE® HD转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 遗传霉素（G418） | Thermo Fisher | 10131035 | |
| 蛋白检测 | 抗POLR1A抗体 | Santa Cruz | Sc-48385 |
| 抗RNA聚合酶II CTD抗体 | Abcam | ab817 | |
| 抗RNA聚合酶II NTD抗体 | CST | D8L4Y | |
| 抗POLR3A抗体 | Abcam | ab96328 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| 抗HA标签抗体 | Abcam | ab9110 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 抗RPAC1抗体 | Santa Cruz | Sc-374443 | |
| 抗SSRP1抗体 | Biolegend | 609710 | |
| 抗SUPT16H抗体 | Santa Cruz | Sc-165987 | |
| 抗INTS3抗体 | Proteintech | 16620-1-AP | |
| 抗INTS11抗体 | ABclonal | A6566 | |
| 抗TBP抗体 | Proteintech | 22006-1-AP | |
| 抗RNA Pol II S2p抗体 | CST | 13499 | |
| 抗H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| 抗C-MYC抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| 抗RPB3抗体 | Proteintech | 13428-1-AP | |
| 抗RPB5抗体 | Proteintech | 15217-1-AP | |
| 抗RPB6抗体 | Proteintech | 15334-1-AP | |
| 抗RPB8抗体 | Proteintech | 15086-1-AP | |
| 抗RPB11抗体 | Proteintech | 16403-1-AP | |
| 抗RPAC1抗体 | Proteintech | 15923-1-AP | |
| 抗兔IgG二抗 | GE Healthcare | NA931V | |
| 抗小鼠IgG二抗 | GE Healthcare | NXA931V | |
| 正常小鼠IgG | Merck Millipore | 12-370 | |
| 正常兔IgG | Merck Millipore | 12-370 | |
| Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| Complete蛋白酶抑制剂片（无EDTA，易撕装） | Roche | 04693132001 | |
| EU-Seq | 5-乙炔基尿苷 | J&K | 1388360 |
| 生物素-PEG3-叠氮化物 | Aladdin | B122225 | |
| THPTA | Sigma | 762342 | |
| 抗坏血酸钠 | Sigma | A7631 | |
| ChIP | Dynabeads™ 蛋白G磁珠 | Thermo Fisher | 10004D |
| PRO-Seq | Dynabeads™ M-280链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | 11205D |
| 文库构建 | NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | E7645S |
| ATAC-Seq | Illumina Nextera DNA样本制备试剂盒 | Illumina | FC-121-1030 |
| 分子克隆 | KOD FX聚合酶 | TOYOBO | KFX-101 |
| 2×Taq预混液（含染料） | Vazyme | P112-02 | |
| pEASY-Basic无缝克隆和组装试剂盒 | TransGen | CU201-03 | |
| 文库构建 | KAPA HIFI热启动PCR试剂盒 | Kapa Biosystems | KK2502 |
| PRO-Seq | SuperScript™ III逆转录酶 | Thermo Fisher | 18080085 |
| P-30无RNase离心柱 | BioRad | 732-6250 | |
| ChIP | 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S |
| qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 |
| DNA纯化 | Megen凝胶回收试剂盒 | Megen | D2111-03 |
| 质粒提取 | HiPure质粒EF小提试剂盒 | Magen | P1112-02 |
| 文库定量 | Qubit双链DNA高灵敏度定量试剂盒 | Thermo Fisher | Q32851 |
| RNA提取 | TRIzol | Thermo Fisher | -- |
| DRB处理 | 5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-呋喃核糖苷 | -- | -- |
| 质谱检测 | Q-Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和degron诱导 | 细胞系：V6.5 mESCs；处理：1 μg/ml doxycycline预处理12小时，500 μM IAA处理指定时间；Pol II CTD-degron细胞用于后续实验（除另有说明） 阅读提示：Methods: Mouse ES cell culture和Plasmid construction and gene targeting |
| 急性耗竭的验证 | Western blot检测目标蛋白降解效率；PRO-Seq确认转录抑制程度 阅读提示：Results: Disruption of Pol I, Pol II, or Pol III transcription in mESCs；Methods: Western blotting和PRO-Seq |
| ChIP-Seq | 固定条件：1%甲醛10分钟；MNase消化：40 U MNase，37°C 15分钟；抗体：使用相应的抗体；ChIP-Seq文库构建使用NEBNext Ultra II Kit；测序模式：HiSeqXten 150bp paired-end 阅读提示：Methods: ChIP-Seq/qPCR, ChIP-mass spectrometry和ChIP-Seq mapping and analysis |
| PRO-Seq | 细胞用量：~10^7；加入5%果蝇S2细胞作为spike-in；核裂解和核连缀反应条件（如biotin-11-CTP浓度等）；RNA提取和链霉亲和素富集；文库构建和测序 阅读提示：Methods: PRO-Seq和PRO-Seq and chromatin-associated RNA-Seq (ChAR-Seq) mapping and analysis |
| ATAC-Seq | 细胞数量：50,000 viable cells；使用Nextera DNA Sample Prep Kit；PCR扩增后凝胶纯化；测序：HiSeqXten 150bp paired-end 阅读提示：Methods: ATAC-Seq和ATAC-Seq mapping and analysis |
| EU-Seq | EU浓度：1 mM，处理10分钟；使用Drosophila S2细胞作为spike-in；点击化学标记和生物素富集条件 阅读提示：Methods: EU-Seq |
| ChIP-MS | ChIP-MS采用DDA和DIA两种模式；蛋白质消化和质谱参数；数据分析标准（如PSM归一化、差异蛋白筛选阈值） 阅读提示：Methods: ChIP-MS data analysis |
| DRB转录抑制释放实验 | DRB浓度：100 μM；处理时间：3.5小时；IAA处理：在DRB处理最后1小时加入500 μM IAA；释放时间点：0, 10, 20分钟 阅读提示：Methods: DRB treatment ChIP-qPCR |