TuD文库构建
生成靶向171个高丰度肝细胞miRNA的成对抑制文库
基于AGO2结合miRNA数据设计MBS，通过顺序连接构建包含超过30,000种TuD的质粒文库（TuDstd和TuDtail），并包含阴性对照MBS。
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高内涵筛选鉴定调控小鼠损伤后肝再殖的微小RNA
A High-Content Screen Identifies MicroRNAs That Regulate Liver Repopulation After Injury in Mice
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（Hepa 1-6双荧光素酶、克隆形成）、体内Fah−/−小鼠模型筛选、TRAP-Seq转录组分析及功能验证（竞争性再殖实验），涉及多层级证据。
主要模型
Fah−/−小鼠肝再殖模型 Hepa 1-6小鼠肝癌细胞系 Huh-7人肝癌细胞系
重点核对
Fah−/−小鼠品系（C57BL/6j）及nitisinone处理浓度（7.5 μg/mL） TuD质粒文库（>30,000种）的构建与递送方式（水动力尾静脉注射） 肝再殖诱导时间（4周）及观察终点 TRAP-Seq实验动物分组（TuDctrl n=5, TuD374 n=6）及处理时间（2周） 竞争性再殖实验小鼠性别（雌性）及年龄（2个月）
摘要
背景与目的：肝细胞特异性微小RNA（miRNA）加工缺陷的小鼠肝再生受损，但尚不清楚哪些miRNA调控该过程。我们利用Fah−/−小鼠开发了一种高通量筛选方法，以鉴定调控中毒性肝损伤后肝细胞再殖的miRNA。方法：我们构建了编码超过30,000个tough decoy RNA抑制剂（发夹核酸，旨在特异性抑制miRNA与其靶标之间的相互作用）的质粒库，以成对方式靶向肝细胞miRNA。在肝损伤时通过水动力尾静脉注射将质粒文库递送至Fah−/−小鼠的肝细胞。肝再殖后通过高通量测序定量整合的含有转基因的转座子。通过翻译核糖体亲和纯化结合高通量测序测定miRNA抑制后多聚体结合转录本的变化。结果：对肝细胞基因组DNA和输入质粒库中tough decoy丰度的分析确定了几千个在再殖后显著丢失或获得的miRNA抑制剂。我们将一部分miRNA结合位点归类为对肝再殖具有强效应的位点，表明所靶向的肝细胞miRNA是该过程的调控因子。随后，我们生成了171个miRNA结合位点之间成对相互作用的高内涵图谱，并鉴定了协同和冗余效应。结论：我们开发了一种筛选方法来鉴定活体小鼠肝损伤后肝再生所需的miRNA。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些miRNA及其成对相互作用调控小鼠肝损伤后的肝再殖？
- 核心机制
- miR-374b-5p通过靶向Mex3c mRNA（其编码蛋白抑制PTEN的磷酸酶活性），从而促进肝细胞增殖和肝再殖。
- 主要证据
- TuD文库筛选、TRAP-Seq、双荧光素酶报告实验、克隆形成实验、竞争性肝再殖实验。
- 研究意义
- 首个对哺乳动物组织miRNA组进行系统性功能测试的研究，为治疗性刺激天然肝脏恢复提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TuD文库体内筛选
鉴定影响肝再殖的miRNA及其相互作用
将TuD文库质粒通过水动力尾静脉注射递送至Fah−/−小鼠，通过nitisinone withdrawal诱导肝损伤和再殖，4周后分析肝细胞基因组DNA中TuD丰度。
鉴定个体miRNA结合位点效应
量化单个MBS对肝再殖的影响
基于TuD丰度变化计算每个MBS的表型分数和强度分数，并与Bradley-Terry模型进行比较。
成对miRNA相互作用的表型分析
识别miRNA之间的上位效应
计算每个TuD的miRNA相互作用（MI）分数和修正t分数（MIT），进行层次聚类分析。
miR-374b-5p功能验证
验证miR-374b-5p抑制对肝再殖的影响
使用表达TuD374或TuDctrl的TRAP质粒，通过TRAP-Seq分析转录组变化，并进行竞争性再殖实验。
靶基因鉴定
确定miR-374b-5p的直接靶基因
使用双荧光素酶报告实验验证Mex3c 3'UTR，并进行克隆形成实验和triptolide处理实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- |
| 质粒提取 | 无内毒素大提质粒试剂盒 | Qiagen | -- |
| TRAP-Seq | 抗GFP抗体（Htz-GFP-19F7和Htz-GFP-19C8） | Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility | -- |
| Absolutely RNA微量制备试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina用） | New England BioLabs | -- | |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | New England BioLabs | -- | |
| 免疫组织化学 | 兔抗FAH抗体 | -- | -- |
| 山羊抗GFP抗体 | Abcam | Ab6673 | |
| 兔抗MEX3C抗体 | Proteintech | 22882-1-AP | |
| 测序 | Illumina NextSeq 500 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Fah−/−小鼠模型与饲养 | 小鼠品系（C57BL/6j）；nitisinone浓度（7.5 μg/mL）；饲养条件；尾静脉注射时小鼠年龄和性别。 阅读提示：Methods: Fah−/− mouse model of hereditary tyrosinemia type I |
| TuD文库构建与质粒制备 | MBS选择标准（AGO2结合，≥0.01% reads，无polyA等）；文库包含177个MBS；TuDstd和TuDtail设计差异（有无终止信号pT）；质粒提取试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit）。 阅读提示：Methods: MicroRNA-binding site (MBS) design and TuD library generation |
| 体内TuD文库筛选 | 质粒注射量（10 μg）；注射体积（体重的10%）；注射溶液（Ringer's lactate）；nitisinone撤除时机；4周后取材；肝组织采集部位（多叶）。 阅读提示：Methods: MicroRNA inhibition in the mouse liver; Results: High coverage of tough decoy libraries |
| TRAP-Seq实验 | TRAP质粒的构建（TuD374/TuDctrl）；注射剂量、体积；动物性别、年龄、数量（n=5/6）；再殖时间（2周）；肝组织用量（500 mg）；裂解和GFP抗体结合条件；RNA提取试剂盒和文库制备试剂盒。 阅读提示：Methods: TRAP-Seq; Results: MicroRNA-374b inhibition in hepatocytes accelerates liver repopulation |
| 竞争性再殖实验 | 质粒混合比例（约1% TRAP质粒+98% pKT2-Fah）；小鼠性别（雌性）、年龄（2个月）、数量（n=7）；再殖时间（4周）。 阅读提示：Methods: MicroRNA inhibition in the mouse liver; Results: MicroRNA-374b inhibition in hepatocytes accelerates liver repopulation |