建立肝肺转移模型
建立可比对的肝和肺转移性PDAC小鼠模型，以研究不同转移部位的TME差异。
使用KPC细胞系（Kras和Trp53突变）通过半脾门静脉注射建立肝转移模型，通过尾静脉注射建立肺转移模型。第21天收获组织，并通过大体和组织学验证肿瘤负荷。
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转移性胰腺癌肝肺肿瘤微环境的多组学分析揭示位点特异性免疫调节通路
Multi-omic profiling of lung and liver tumor microenvironments of metastatic pancreatic cancer reveals site-specific immune regulatory pathways
实验完整度
高包含质谱流式（CyTOF）、RNAseq、免疫组化（IHC）和TCR测序等多种技术，并在小鼠模型和人类快速尸检样本中进行验证，且进行了功能验证和机制验证。
主要模型
KPC小鼠肝转移模型（半脾注射） KPC小鼠肺转移模型（尾静脉注射） 人PDAC快速尸检配对肝肺转移样本 TCGA_LIHC/LUAD/LUSC数据集
重点核对
KPC细胞注射途径及数量：肝转移采用半脾法注射3.5×10^5细胞，肺转移采用尾静脉注射5×10^5细胞 组织处理：肝脏和肺样本使用Miltenyi解离试剂盒酶解，非免疫细胞富集采用Tumor Isolation Kit负选 免疫标记物：CyTOF使用33通道抗体panel，IHC使用CD4、CD8、CD68、B220等抗体 转移模型时间点：接种后第21天取材 统计分析：CyTOF数据采用diffcyt、edgeR等，RNAseq采用DESeq2
摘要
背景：大多数胰腺导管腺癌（PDAC）在诊断时已处于转移阶段，标准疗法疗效有限，5年生存率仅为8%。肝脏和肺是PDAC转移最常见的部位，且与预后和全身治疗反应的相关性不同。深入了解这些不同部位转移灶肿瘤微环境（TME）内的分子和细胞景观，对于制定针对转移性PDAC的未来治疗策略至关重要。结果：通过结合质谱流式细胞术、免疫组织化学和RNA测序，我们在转移性PDAC的临床前小鼠模型中鉴定了区分肝和肺TME的关键调节通路。我们证明，肺TME通常表现出更高水平的免疫浸润、免疫激活和促免疫信号通路，而肝TME则强调多种免疫抑制通路。随后，我们使用来自PDAC快速尸检标本的配对人类肝和肺转移样本，通过免疫组织化学对这些临床前发现进行了进一步验证。最后，利用我们的小鼠模型与TCGA数据集之间的迁移学习进行计算机模拟验证，进一步证明即使在不同的原发肿瘤背景下，许多位点相关特征也是可检测的。结论：确定多个肝和肺TME数据集中的独特免疫抑制特征，可进一步深入了解分子和细胞通路的组织特异性，提示了转移性疾病中经常观察到的临床反应不一致的潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝和肺转移性PDAC的肿瘤微环境是否存在位点特异性的免疫调节差异，以及这些差异是否由组织内在特性决定？
- 核心机制
- 肝TME中强调免疫抑制通路，包括FGL1-LAG3和CXCL12-CXCR4，而肺TME则表现出更高的免疫激活和促免疫信号。
- 主要证据
- 通过CyTOF、RNAseq和IHC分析发现，肺TME中免疫浸润和激活更高，肝TME中免疫抑制通路富集，并在配对人肝肺转移样本中验证。
- 研究意义
- 揭示转移性PDAC中不同转移部位的免疫微环境差异，为针对肝转移患者开发LAG3抑制剂和CXCR4靶向治疗等策略提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱流式分析免疫细胞组成
表征肝和肺转移TME中免疫细胞的组成和功能状态。
使用33通道CyTOF panel对正常和荷瘤肝脏和肺的免疫细胞进行高维分析，通过FlowSOM聚类并注释免疫细胞亚型。
T细胞亚群深入分析
深入分析T细胞亚群，验证肝转移中LAG3+ T细胞的存在。
对CD3+事件重新聚类，并利用荧光流式细胞术验证LAG3+ CD8 T细胞和NK细胞比例。同时，进行TCR测序分析样本克隆性。
非免疫组分RNAseq分析
分析非免疫组分（肿瘤细胞、基质细胞等）的转录组特征，鉴定免疫调节通路。
分离非免疫细胞并进行RNAseq，比较肝和肺转移微环境中的基因表达差异，重点分析PDL1通路和FGL1-LAG3网络。
免疫组化验证
在蛋白水平上验证免疫细胞浸润和免疫检查点分子的表达。
对小鼠组织进行CD8、CD4、CD68、B220免疫组化染色，定量细胞密度；对人快速尸检样本进行CD4、CD8、CD20、CD68和PD1、LAG3染色。
TCGA和MetMap数据验证
验证小鼠模型中观察到的位点特异性特征是否在人类原发肿瘤中保守。
使用迁移学习算法projectR将KPC模型的前导成分投影到TCGA数据集中，并利用MetMap数据验证组织内在信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 动物实验 | C57Bl/6小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
| 组织解离 | 肺解离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| 肝解离试剂盒 | Miltenyi | -- | |
| 细胞分离 | 肿瘤分离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| RNA提取 | Quick-RNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| CyTOF | Maxpar镧系元素偶联试剂盒 | Fluidigm | -- |
| CyTOF1质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- |
| NEBNext Ultra II 定向RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 免疫组化（人） | CD4抗体（SP35） | Ventana | -- |
| CD8抗体（C8/144B） | Cell Marque | -- | |
| CD20抗体（L26） | Ventana | -- | |
| CD68抗体（KP-1） | Ventana | -- | |
| PD1抗体（NAT105） | Cell Marque | -- | |
| Lag3抗体（17B4） | LifeSpan BioSciences | -- | |
| 免疫组化（小鼠） | CD8抗体（D4W2Z） | Cell Signaling Technologies | -- |
| CD4抗体（EPR19514） | Abcam | -- | |
| B220抗体（RA3-6B2） | Novus Biologicals | -- | |
| CD68抗体（兔多克隆） | Abcam | -- | |
| 流式细胞术（验证） | CD45抗体（30-F11, FITC） | Biolegend | -- |
| CD3抗体（145-2C11, Pacific Blue） | Biolegend | -- | |
| CD4抗体（RM4-5, BV605） | BD Biosciences | -- | |
| CD8抗体（53-6.7, BV786） | BD Biosciences | -- | |
| NK1.1抗体（PK136, APC） | Biolegend | -- | |
| Lag3抗体（C9B7W, PE） | Biolegend | -- | |
| CyTOF | CD45抗体（条形码） | Fluidigm | -- |
| 顺铂溶液 | Fluidigm | -- | |
| Foxp3转录因子固定/透化试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 铱 | Fluidigm | -- | |
| 组织处理 | gentleMACS Octo解离器（带加热器） | Miltenyi | -- |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫组化（扫描） | Aperio ScanScope CS扫描系统 | Leica | -- |
| 免疫组化（定量） | HALO病理图像分析软件 | Indica Labs | -- |
| TCR测序 | immunoSEQ检测 | Adaptive Biotechnologies | -- |
| RNA测序（建库） | NEBNext Ultra II 定向RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| RNA测序（质控） | 生物分析仪 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | KPC细胞系（KrasLSL.G12D/+;p53R172H/+;PdxCretg/+）及其培养条件（RPMI培养基，10% FBS，0.1 mM非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠，1X青霉素/链霉素，5% CO2） 阅读提示：材料和方法 - 细胞系 |
| 动物模型 | 雌性C57Bl/6小鼠，6-8周龄，肝转移采用半脾法注射3.5×10^5细胞，肺转移采用尾静脉注射5×10^5细胞，第21天取材 阅读提示：材料和方法 - 动物；结果 - 建立肝肺转移模型 |
| 质谱流式 | CyTOF panel（33个质量通道），样本处理（解离、活死染色、CD45条形码）、抗体克隆和滴定、数据分析（FlowSOM、diffcyt） 阅读提示：材料和方法 - CyTOF染色和预处理；补充表S1 |
| RNAseq | 样本制备（非免疫细胞富集，Tumor Isolation Kit）、文库构建（NEBNext Ultra II）、测序平台（NovaSeq6000）、分析（salmon、DESeq2） 阅读提示：材料和方法 - RNAseq数据获取和预处理 |
| 免疫组化 | 抗体（克隆号、稀释度、抗原修复）、染色条件（自动染色机） 阅读提示：材料和方法 - 免疫组织化学；图例S6、S12 |