泛素特异性蛋白酶12和13去除H2Aub1是拟南芥中稳定的Polycomb介导的基因抑制所必需的

Removal of H2Aub1 by ubiquitin-specific proteases 12 and 13 is required for stable Polycomb-mediated gene repression in Arabidopsis

作者信息Lejon E M Kralemann, Shujing Liu, Minerva S Trejo-Arellano, Rafael Muñoz-Viana, Claudia Köhler, Lars Hennig
PMID32546254
发布时间2020-06-16
DOI10.1186/s13059-020-02062-8

实验完整度

高

包含转录组、ChIP-seq、Western blot及突变体表型分析等多层级验证,并整合已发表数据,涵盖分子、基因组和表型水平。

主要模型

拟南芥Col-0野生型及ubp12-1 ubp13-3双突变体 ubp12-1、ubp13-3单突变体 REF6-GFP ref6转基因株系

重点核对

UBP12/13靶基因的鉴定依赖于H2Aub1 ChIP-seq中增加的peak,需确认突变体背景和野生型对照的遗传背景 H3K27me3的变化需验证是否由于PRC2组分表达变化引起 REF6与H2Aub1的关联需通过REF6 ChIP-seq确认 H2A.Zub1抗体交叉反应性需考虑,需区分H2Aub1和H2A.Zub1

摘要

背景 稳定的基因抑制对正常生长发育至关重要。Polycomb抑制复合物1和2(PRC1和PRC2)通过建立组蛋白2A的单泛素化(H2Aub1)和随后组蛋白3赖氨酸27的三甲基化(H3K27me3)参与这一过程。先前的研究提出,由泛素特异性蛋白酶12和13(UBP12和UBP13)去除H2Aub1是抑制性PRC1和PRC2系统的一部分,但其功能作用仍不明确。 结果 我们表明,UBP12和UBP13与PRC1、PRC2和EMF1协同抑制参与刺激应答的基因。我们发现,PRC1介导的H2Aub1与基因响应性相关,其抑制功能需要PRC2的招募。我们进一步表明,PRC1对PRC2招募的需求取决于基因的初始表达状态。最后,我们证明,UBP12/13去除H2Aub1可防止H3K27me3的丢失,这与我们发现H3K27me3去甲基化酶REF6与H2Aub1正相关一致。 结论 我们的数据使我们能够提出一个模型,在该模型中,H2Aub1的沉积允许基因通过H3K27me3的沉积和去除在抑制和激活之间切换。UBP12/13去除H2Aub1是实现PRC2介导的稳定抑制所必需的。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
UBP12和UBP13通过去除H2Aub1如何促进Polycomb介导的基因抑制?
核心机制
PRC1介导的H2Aub1沉积使基因处于可响应状态,并促进PRC2招募;而UBP12/13去除H2Aub1可防止H3K27me3去甲基化酶REF6的招募,从而维持H3K27me3水平,实现稳定的基因抑制。
主要证据
通过RNA-seq、ChIP-seq和Western blot分析,发现ubp12/13突变体中H2Aub1增加与H3K27me3减少相关,且REF6优先结合H2Aub1标记的基因。
研究意义
该研究揭示了H2Aub1作为动态标记的机制,为理解植物中Polycomb介导的基因抑制与刺激响应之间的平衡提供了新模型。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

UBP12/13突变体表型及转录组分析

确定UBP12/13在基因抑制中的功能及冗余性

对2周龄的ubp12-1、ubp13-3单突变体和ubp12-1 ubp13-3双突变体进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,并进行GO分析和主成分分析。

2

UBP12/13靶基因的鉴定

通过H2Aub1 ChIP-seq鉴定UBP12/13的直接靶基因

对33天莲座叶进行H2Aub1 ChIP-seq,比较ubp12/13突变体与野生型,鉴定H2Aub1增加的基因,定义为UBP12/13靶基因。

3

H2Aub1与H3K27me3的关系分析

探究H2Aub1与H3K27me3在基因抑制中的关系

分析UBP12/13靶基因上H3K27me3的变化,并比较PRC1依赖与非依赖基因的表达和H3K27me3水平。

4

REF6与H2Aub1的关联分析

验证H2Aub1是否招募H3K27me3去甲基化酶REF6

使用REF6-GFP株系进行ChIP-seq,分析REF6在H2Aub1峰顶点的富集,并检测ubp12/13突变体中REF6结合的变化。

5

H2A.Z的作用分析

排除H2A.Zub1在UBP12/13功能中的混淆因素

进行H2A.Z ChIP-seq,分析UBP12/13靶基因是否富含H2A.Z,并利用H2A.Zub1不能泛素化的突变体数据检验UBP12/13靶基因的表达变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
anti-H3Merck Millipore07-690
anti-H2Aub1Cell Signaling Technology8240S
anti-HTA9AgriseraAS10
anti-H3K27me3Merck Millipore07-449
anti-H4Merck Millipore05-858
anti-GFPThermo Fisher ScientificA11122
MagJET植物RNA纯化试剂盒Thermo Fisher Scientific--
TRUseq RNA样本制备试剂盒v2Illumina--
HiSeq2000Illumina--
Ipure试剂盒v2Diagenode--
MicroPlex文库制备试剂盒v2Illumina--
Ovation Ultralow系统V2NuGEN--
蛋白质A磁珠Thermo Fisher Scientific--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
植物材料培养
生长条件:长日照(16小时光照/8小时黑暗),22±2°C;突变体等位基因ubp12-1(GABI_244E11),ubp13-3(SALK132368),ubp12-2w(GABI_742C10)
阅读提示:Methods: Plant material
RNA-seq
组织:2周龄整株幼苗;生长培养基:1/2 MS;RNA提取试剂盒:MagJET植物RNA纯化试剂盒;文库制备:TRUseq RNA样本制备试剂盒v2;测序平台:Hiseq2000(50bp单端);生物学重复数:3
阅读提示:Methods: RNA sequencing
ChIP-seq
组织:33天莲座叶(H2Aub1/H2A.Z/H3K27me3)或12天幼苗(REF6?);交联:甲醛真空渗透,H2Aub1/H2A.Z和H3K27me3为2×5分钟,REF6为2×10分钟;终止:0.125M甘氨酸;核提取量:H2Aub1/H2A.Z约300mg,H3K27me3约500mg,REF6约200mg;超声:8个循环(30秒开/30秒关);抗体:anti-H2Aub1 (#8240S), anti-H2A.Z (AS10 718), anti-H3K27me3 (07-449), anti-GFP (A11122);磁珠:protein A Dynabeads;DNA回收:Ipure kit v2;文库制备:MicroPlex(H2Aub1/H2A.Z),Ovation Ultralow(H3K27me3/REF6);测序:Hiseq2000(50bp单端)或HiseqX(150bp双端);生物学重复:2
阅读提示:Methods: H2Aub1, H2A.Z, H3K27me3, and REF6 ChIP-seq