UBP12/13突变体表型及转录组分析
确定UBP12/13在基因抑制中的功能及冗余性
对2周龄的ubp12-1、ubp13-3单突变体和ubp12-1 ubp13-3双突变体进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,并进行GO分析和主成分分析。
Removal of H2Aub1 by ubiquitin-specific proteases 12 and 13 is required for stable Polycomb-mediated gene repression in Arabidopsis
包含转录组、ChIP-seq、Western blot及突变体表型分析等多层级验证,并整合已发表数据,涵盖分子、基因组和表型水平。
拟南芥Col-0野生型及ubp12-1 ubp13-3双突变体 ubp12-1、ubp13-3单突变体 REF6-GFP ref6转基因株系
UBP12/13靶基因的鉴定依赖于H2Aub1 ChIP-seq中增加的peak,需确认突变体背景和野生型对照的遗传背景 H3K27me3的变化需验证是否由于PRC2组分表达变化引起 REF6与H2Aub1的关联需通过REF6 ChIP-seq确认 H2A.Zub1抗体交叉反应性需考虑,需区分H2Aub1和H2A.Zub1
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定UBP12/13在基因抑制中的功能及冗余性
对2周龄的ubp12-1、ubp13-3单突变体和ubp12-1 ubp13-3双突变体进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,并进行GO分析和主成分分析。
通过H2Aub1 ChIP-seq鉴定UBP12/13的直接靶基因
对33天莲座叶进行H2Aub1 ChIP-seq,比较ubp12/13突变体与野生型,鉴定H2Aub1增加的基因,定义为UBP12/13靶基因。
探究H2Aub1与H3K27me3在基因抑制中的关系
分析UBP12/13靶基因上H3K27me3的变化,并比较PRC1依赖与非依赖基因的表达和H3K27me3水平。
验证H2Aub1是否招募H3K27me3去甲基化酶REF6
使用REF6-GFP株系进行ChIP-seq,分析REF6在H2Aub1峰顶点的富集,并检测ubp12/13突变体中REF6结合的变化。
排除H2A.Zub1在UBP12/13功能中的混淆因素
进行H2A.Z ChIP-seq,分析UBP12/13靶基因是否富含H2A.Z,并利用H2A.Zub1不能泛素化的突变体数据检验UBP12/13靶基因的表达变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质印迹 | anti-H3 | Merck Millipore | 07-690 |
| anti-H2Aub1 | Cell Signaling Technology | 8240S | |
| anti-HTA9 | Agrisera | AS10 | |
| anti-H3K27me3 | Merck Millipore | 07-449 | |
| anti-H4 | Merck Millipore | 05-858 | |
| anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A11122 | |
| RNA提取 | MagJET植物RNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq文库构建 | TRUseq RNA样本制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| RNA测序 | HiSeq2000 | Illumina | -- |
| ChIP-seq DNA回收 | Ipure试剂盒v2 | Diagenode | -- |
| ChIP-seq文库构建 | MicroPlex文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| Ovation Ultralow系统V2 | NuGEN | -- | |
| ChIP-seq | 蛋白质A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 植物材料培养 | 生长条件:长日照(16小时光照/8小时黑暗),22±2°C;突变体等位基因ubp12-1(GABI_244E11),ubp13-3(SALK132368),ubp12-2w(GABI_742C10) 阅读提示:Methods: Plant material |
| RNA-seq | 组织:2周龄整株幼苗;生长培养基:1/2 MS;RNA提取试剂盒:MagJET植物RNA纯化试剂盒;文库制备:TRUseq RNA样本制备试剂盒v2;测序平台:Hiseq2000(50bp单端);生物学重复数:3 阅读提示:Methods: RNA sequencing |
| ChIP-seq | 组织:33天莲座叶(H2Aub1/H2A.Z/H3K27me3)或12天幼苗(REF6?);交联:甲醛真空渗透,H2Aub1/H2A.Z和H3K27me3为2×5分钟,REF6为2×10分钟;终止:0.125M甘氨酸;核提取量:H2Aub1/H2A.Z约300mg,H3K27me3约500mg,REF6约200mg;超声:8个循环(30秒开/30秒关);抗体:anti-H2Aub1 (#8240S), anti-H2A.Z (AS10 718), anti-H3K27me3 (07-449), anti-GFP (A11122);磁珠:protein A Dynabeads;DNA回收:Ipure kit v2;文库制备:MicroPlex(H2Aub1/H2A.Z),Ovation Ultralow(H3K27me3/REF6);测序:Hiseq2000(50bp单端)或HiseqX(150bp双端);生物学重复:2 阅读提示:Methods: H2Aub1, H2A.Z, H3K27me3, and REF6 ChIP-seq |