SLIM-seq分析m6A动态图谱
揭示MZT过程中mRNA m6A修饰的动态变化。
使用SLIM-seq方法对MII卵母细胞、L1C和L2C胚胎进行m6A测序，并结合RNA-seq分析，鉴定m6A修饰的mRNA和ncRNA，并分析其动态变化。
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mRNA m6A修饰的读写调控小鼠母源-合子转变
Reading and writing of mRNA m6A modification orchestrate maternal-to-zygotic transition in mice
实验完整度
高包含SLIM-seq、RNA-seq、LiRibo-seq、低输入蛋白质组学等多组学分析，并通过CRISPR-Cas13d敲低胚胎功能验证、RIP-qPCR验证机制、体内培养至囊胚评估发育（两个以上独立证据层级，含功能验证与机制验证）。
主要模型
小鼠MII卵母细胞 小鼠晚期1细胞胚胎 小鼠晚期2细胞胚胎 B6D2F1小鼠品系
重点核对
SLIM-seq分析时的胚胎数量、遗传背景或受精方式差异 Ythdc1和Ythdf2敲低使用的Cas13d mRNA和crRNA浓度均为300 ng/μL，注射体积1-3 pL Ythdc1敲低后L2C胚胎RNA-seq分析（Smart-seq2） RIP-qPCR中收集150个L2C胚胎（三次重复） ActD处理浓度5 μg/mL
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）修饰已被证明能够调控RNA代谢。在此，我们通过多组学分析研究了小鼠母源-合子转变（MZT）过程中m6A的动态变化。我们的结果表明，m6A可以母源遗传或在受精后从头获得。有趣的是，母源mRNA上的m6A修饰不仅与mRNA降解相关，还能维持一小部分mRNA的稳定性，从而促进它们在受精后的翻译。我们鉴定出Ythdc1和Ythdf2是小鼠植入前发育的关键m6A阅读器。我们的研究揭示了m6A介导的RNA代谢在哺乳动物MZT中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A修饰在小鼠母源-合子转变过程中如何动态变化并参与RNA代谢调控？
- 核心机制
- m6A修饰既可促进部分母源mRNA降解，又能维持一小部分母源mRNA的稳定性以促进翻译；Ythdc1通过结合m6A标记的mRNA维持其稳定性，Ythdf2在合子基因组激活后发挥作用。
- 主要证据
- SLIM-seq、RNA-seq、LiRibo-seq和低输入蛋白质组学显示m6A动态变化及稳定RNA的翻译；CRISPR-Cas13d敲低实验表明Ythdc1和Ythdf2缺失降低囊胚率；RIP-qPCR和ActD实验证明Ythdc1维持m6A标记mRNA的稳定性。
- 研究意义
- 揭示了m6A介导的RNA代谢在哺乳动物MZT中的关键作用，为理解早期胚胎发育的调控机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
整合翻译组和蛋白质组分析
验证母源遗传的m6A标记mRNA是否被主动翻译。
整合已发表的LiRibo-seq数据和自产的低输入蛋白质组学数据，分析m6A标记基因的翻译状态和蛋白表达。
CRISPR-Cas13d敲低m6A调控因子
评估m6A相关调控因子对早期胚胎发育的影响。
通过显微注射Cas13d mRNA和crRNA敲低十个m6A调控因子，培养胚胎评估囊胚形成率。
Ythdc1敲低转录组分析
研究Ythdc1对m6A标记mRNA的调控作用。
对Ythdc1敲低和对照的L2C胚胎进行Smart-seq2转录组分析，鉴定DEGs并与m6A标记基因重叠分析。
RIP-qPCR和mRNA稳定性分析
验证Ythdc1与m6A标记mRNA的结合及其对mRNA稳定性的影响。
对L2C胚胎进行RIP-qPCR分析Ythdc1结合的m6A标记mRNA，并通过ActD处理结合敲低实验检测mRNA稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测m6A修饰图谱
分析转录组表达
分析翻译状态
分析蛋白表达
基因功能敲低
验证RNA-蛋白结合
检测基因表达
蛋白检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 超排卵处理 | 孕马血清促性腺激素 | San-sheng Biotechnology | 110914564 |
| 人绒毛膜促性腺激素 | San-sheng Biotechnology | 110911282 | |
| 去除卵丘细胞 | 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H4272 |
| 胚胎显微注射及处理 | 细胞松弛素B | Sigma-Aldrich | C6762 |
| 胚胎培养 | HTF培养基 | Sigma-Aldrich | MR-070-D |
| 胚胎操作 | M2培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 |
| 胚胎培养 | KSOM培养基 | Sigma-Aldrich | MR-101-D |
| 缓冲液配制 | NP-40 | Sigma-Aldrich | I3021 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| 免疫沉淀 | Protein A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88845 |
| 体外转录 | mMESSAGE mMACHINE™ T7转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1344 |
| cDNA纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman | A63881 |
| RNA酶抑制剂 | RNasin | Vazyme | -- |
| 测序文库构建 | TruePrep® DNA文库制备试剂盒V2 | Vazyme | TD501 |
| qRT-PCR | ChamQ SYBR Color qPCR预混液（无ROX） | Vazyme | Q321 |
| RNA纯化 | RNA纯化磁珠 | Novoprotein | N243-01B |
| 体外转录 | T7高产RNA转录试剂盒 | Novoprotein | E131 |
| 基因敲除 | NLS-Cas9核酸酶 | Novoprotein | E365-01A |
| PCR扩增 | KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 |
| m6A免疫沉淀 | 抗m6A抗体 | Abcam | ab15320 |
| 免疫沉淀 | 抗Ythdc1抗体 | Proteintech | 14392-1-AP |
| Western blot内参 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 |
| 蛋白质组学分析 | timsTOF质谱仪 | Bruker | -- |
| nanoElute®纳升液相色谱 | Bruker | -- | |
| ReproSil-Pur C18填料 | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| 磁珠 | Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠超排卵与胚胎收集 | 小鼠品系：B6D2F1；年龄：8周；注射PMSG和hCG各10 IU，间隔48小时；MII卵母细胞收集于hCG后14-16小时；L1C和L2C胚胎分别收集于hCG后27-29和48-50小时 阅读提示：Methods: Collection of mouse oocytes and embryos |
| CRISPR-Cas13d敲低实验 | 注射的Cas13d mRNA和crRNA浓度均为300 ng/μL，每种3个crRNA；注射体积1-3 pL；用于敲低效率评估的时间点从注射后6小时到E2.0；囊胚率统计为三次生物学重复，进行t检验 阅读提示：Methods: Preparation of injection mixtures, embryo injection and culture; Results Fig. 2i |
| SLIM-seq与RNA-seq分析 | 每阶段3个生物学重复；SLIM-seq采用100 ng总RNA，anti-m6A抗体0.5 μg；RNA-seq基于Smart-seq2；测序平台Illumina HiSeq X Ten，150 bp双端 阅读提示：Methods: SLIM-seq, RNA-seq library preparation and sequencing; Fig. 1a |
| Ythdc1 RIP-qPCR | L2C胚胎数量：150（三次重复）；Ythdc1抗体2 μg；使用Protein A磁珠10 μL；RNA免疫沉淀后qRT-PCR定量 阅读提示：Methods: RNA Immunoprecipitation (RIP); Fig. 2n |
| ActD处理实验 | ActD浓度5 μg/mL；PN3期合子转入含有ActD的KSOM培养基；微注射和培养均在5 μg/mL ActD存在下进行 阅读提示：Methods: Collection of mouse oocytes and embryos (ActD treatment) |