系统验证与构建
验证紧密匹配的启动子转录因子系统能消除背景，并构建高效基因组整合体系。
构建了Z3PM和Z4PM转录因子，通过流式细胞术验证其激素响应与特异性；构建了Bxb1重组酶介导的基因组整合系统，通过流式细胞术比较其与质粒系统的拷贝数均一性和转化效率。
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基于条形码的CRISPRi系统精确测量分子表型
Precise measurement of molecular phenotypes with barcode-based CRISPRi systems
实验完整度
高包含全基因组CRISPRi筛选、Bxb1介导的基因组整合、流式细胞术、RT-qPCR及个体化验证等多元实验，并涵盖功能验证与机制验证。
主要模型
酿酒酵母BY4742菌株 Z3PM-CL1转录因子报告系统 NMD报告系统（含PTC的YFP报告基因）
重点核对
质粒或基因组整合的报道系统 RNA与DNA条形码归一化方法 诱导浓度：200 nM或135 nM孕酮、250 ng/mL脱水四环素、100 µg/mL放线菌酮 诱导时间：~9小时；放线菌酮处理1小时 每次实验2个生物学重复
摘要
全基因组CRISPR-Cas9筛选已经理清了驱动多种生物过程的调控网络。其成功依赖于探索特定的分子表型，并将关键调控因子与背景效应区分开来。在此，我们通过优化CRISPR干扰与条形码表达报告基因测序（CiBER-seq）相结合，大幅提高了全基因组筛选的灵敏度和范围。我们通过将表达报告基因针对密切匹配的启动子进行归一化，系统地解决了扭曲表型测量的技术因素。我们使用改进后的CiBER-seq准确捕获了经过充分研究的RNA和蛋白质质量控制系统的已知组分。这些结果证明了CiBER-seq在解析细胞通路方面的精确性和多功能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高CiBER-seq在基因组范围筛选中的精度和灵敏度，以准确识别调控特定分子表型的基因？
- 核心机制
- 使用紧密匹配的启动子驱动报告基因和归一化基因，消除了由技术因素和系统效应导致的背景；Bxb1介导的基因组整合减少了质粒拷贝数变异带来的噪音。
- 主要证据
- 在全基因组筛选中，使用Z3PM-CL1报告基因准确识别了Doa10 E3连接酶、26S蛋白酶体和Cdc48复合体等CL1降解通路的大部分已知组分；使用NMD报告基因准确识别了eRF1、eRF3、Upf蛋白和Dcp2等NMD因子。
- 研究意义
- 该优化平台提供了一种通用方法，能够以高灵敏度精确剖析蛋白质和RNA水平上的分子表型，可广泛应用于其他生物过程和物种。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CL1降解子调控因子全基因组筛选
识别影响CL1降解子稳定性的调控基因。
在表达Z3PM-CL1和Z4PM的酵母中，通过Bxb1整合CiBER-seq文库，经脱水四环素诱导CRISPRi，后提取RNA条形码测序，分析barcode比率变化。
NMD调控因子全基因组筛选
识别调控无义介导衰变的基因。
构建含PTC的YFP报告基因和正常mScarlet报告基因，在同一启动子驱动下，进行CiBER-seq筛选，并检测翻译依赖性。
个体化验证
验证筛选得到的候选基因对报告基因表达的影响。
对筛选出的关键基因进行单独的guide RNA诱导，通过RT-qPCR检测报告基因mRNA水平变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 酵母转化 | LiAc/PEG法 | -- | -- |
| 质粒线性化 | PluTI限制酶 | NEB | R0713S |
| 激素处理 | 孕酮 | Sigma-Aldrich | P0130 |
| 流式分析 | BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD | -- |
| 文库构建 | AscI限制酶 | NEB | R0558S |
| BciVI限制酶 | NEB | R0596S | |
| NEBuilder HiFi DNA组装 | NEB | E2621S | |
| Monarch PCR及DNA纯化试剂盒 | NEB | T1030S | |
| MegaX DH10B T1R电转感受态细胞 | ThermoFisher | C640003 | |
| 质粒纯化 | Qiagen中提试剂盒 | Qiagen | 12143 |
| 诱导处理 | 脱水四环素 | Takara Bio | 631310 |
| RNA提取 | GlycoBlue | Invitrogen | AM9515 |
| TURBO DNA酶 | Invitrogen | AM2238 | |
| Xrn1核酸外切酶 | NEB | M0338S | |
| 反转录 | Protoscript II逆转录酶 | NEB | M0368L |
| RNA酶H | Thermo Fisher | EN0531 | |
| RNA酶A | NEB | M0297S | |
| PCR扩增 | Q5热启动高保真DNA聚合酶 | NEB | M0493L |
| PCR纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63882 |
| qPCR定量 | DyNAmo HS SYBR Green qPCR | ThermoFisher | F410L |
| Stratagene Mx300P | Stratagene | -- | |
| 文库片段分析 | Agilent Tapestation 2200 | Agilent | -- |
| 测序 | Illumina Novaseq-X | Illumina | -- |
| 质粒提取 | Zymoprep酵母质粒小提试剂盒II | Zymo Research | D2004 |
| RNA纯化 | Zymo离心柱 | Zymo Research | R1013 |
| RT-qPCR | Breathe-Easy透气膜 | Diversified Biotech | BEM-1 |
| RNA提取 | 甲酰胺 | -- | -- |
| RNA纯化 | Zymo Research RNA纯化试剂盒 | Zymo Research | R1018 |
| 细胞培养 | 96孔U底板 | Corning | 3788 |
| 生长曲线测定 | Tecan Spark酶标仪 | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 启动子选择与报告系统构建 | 使用紧密匹配的P(Z3)和P(Z4)启动子，其转录因子是否高效特异；报告基因是否含有CL1或PTC标记 阅读提示：Methods: Optimized CiBER-seq reporter design and library construction; Fig. 1C-F |
| 基因组整合系统 | Bxb1重组酶是否组成型表达；URA3标记是否正确重构；整合效率及拷贝数是否均一 阅读提示：Methods: Bxb1-mediated integration; Fig. 2 |
| CRISPRi筛选 | 诱导剂浓度（脱水四环素250 ng/mL），诱导时间（约9小时），孕酮浓度（CL1筛选135 nM），放线菌酮处理（100 µg/mL，1小时） 阅读提示：Methods: CiBER-seq screens; Fig. 3C, 4C-D |
| 条形码测序与数据分析 | RNA和DNA条形码提取方法，测序深度，mpra线性模型及显著性阈值（q<0.01，log2FC阈值） 阅读提示：Methods: Analysis of barcode counts and determining guide effects; Fig. 1G-H |