草莓果实发育阶段m6A甲基化组分析
检测草莓果实不同发育阶段（S6、RS1、RS3）m6A甲基化水平及分布变化，探究m6A是否参与非联变性果实成熟。
提取草莓果实总RNA，进行m6A-seq和RNA-seq分析，鉴定m6A peaks，分析m6A分布、差异m6A修饰及与基因表达的相关性，并用m6A-IP-qPCR验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
N6-甲基腺苷RNA修饰以ABA依赖的方式调控草莓果实成熟
N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner
实验完整度
高包含m6A-seq和RNA-seq组学分析、m6A-IP-qPCR验证、mRNA稳定性与翻译效率实验、Y2H/LCI互作验证、亚细胞定位以及农杆菌介导的草莓果实RNAi/过表达功能验证，证据层级多元且含功能验证。
主要模型
二倍体森林草莓（Fragaria vesca cv. "Hawaii-4"）果实 八倍体栽培草莓（Fragaria × ananassa cv. "Benihoppe"）果实 烟草（Nicotiana benthamiana）叶片瞬时表达体系
重点核对
草莓果实发育阶段划分：S6（15 DPA）、RS1（21 DPA）、RS3（27 DPA） m6A-seq及RNA-seq均设置三个独立生物学重复，每个RNA样本混合至少60个果实 农杆菌介导的瞬时转化：果实为八倍体草莓大绿（LG）期，菌液OD600为0.8，培养5-7天，每组至少15个果实 mRNA稳定性实验：放线菌素D浓度为20 μg/mL，取样时间点包括0、3、6小时 翻译效率检测：以GADPH2为内参，计算多聚核糖体RNA与总RNA的丰度比
摘要
背景
表观遗传标记如DNA甲基化在调控联变性和非联变性果实的成熟中发挥重要作用。然而，mRNA m6A甲基化（已被证明可调控典型联变性果实番茄的成熟）在不同类型果实成熟调控中的功能是否保守仍不清楚。
结果
在这里，我们展示了在经典非联变性果实草莓的成熟起始阶段，m6A甲基化发生剧烈变化。编码序列（CDS）区域中的m6A修饰似乎是成熟特异性的，并倾向于稳定mRNA，而终止密码子周围和3'非翻译区内的m6A通常与相关mRNA的丰度呈负相关。我们在CDS区域鉴定出数千个m6A高甲基化转录本，包括脱落酸（ABA）生物合成和信号通路中的NCED5、ABAR和AREB1。我们证明了甲基转移酶MTA和MTB对于草莓果实的正常成熟是必不可少的，并且MTA介导的m6A修饰促进了NCED5和AREB1的mRNA稳定性，同时促进了ABAR的翻译。
结论
我们的发现揭示了m6A甲基化通过靶向ABA通路来调控非联变性草莓果实的成熟，这与联变性番茄果实中的调控机制不同。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mRNA m6A甲基化是否在非联变性果实（草莓）的成熟调控中发挥作用，其机制与联变性果实（番茄）有何不同？
- 核心机制
- m6A甲基转移酶MTA和MTB在草莓果实成熟起始阶段表达升高，介导ABA生物合成与信号通路关键基因（NCED5、AREB1、ABAR）CDS区域的m6A高甲基化，其中NCED5和AREB1的m6A修饰增强其mRNA稳定性，ABAR的m6A修饰促进其翻译效率，从而调控果实成熟。
- 主要证据
- 通过m6A-seq鉴定成熟起始阶段CDS区域m6A高甲基化转录本，m6A-IP-qPCR验证；mRNA稳定性实验显示NCED5/AREB1突变m6A位点后降解加速，翻译效率实验显示ABAR突变m6A位点后翻译效率降低；RNAi/过表达MTA或MTB分别延迟或加速草莓果实成熟，MTA RNAi果实中相关基因m6A水平、mRNA稳定性和翻译效率相应变化。
- 研究意义
- 揭示了m6A甲基化通过靶向ABA通路调控非联变性草莓果实成熟的新机制，与联变性番茄果实中m6A通过调控DNA去甲基化酶SlDML2的机制不同，为果实成熟调控网络提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ABA通路关键基因m6A修饰功能验证
验证ABA生物合成与信号通路基因NCED5、ABAR、AREB1的m6A修饰对其mRNA稳定性和翻译效率的影响。
构建NCED5、ABAR、AREB1的完整CDS及其m6A位点突变体（A突变为G）表达载体，在烟草叶片中瞬时表达，检测mRNA降解速率和翻译效率。
m6A甲基转移酶MTA和MTB功能鉴定
确定MTA和MTB在草莓果实成熟中的功能及其相互作用。
通过RNAi和过表达MTA或MTB进行草莓果实瞬时转化，观察果实成熟表型；通过Y2H、LCI、亚细胞定位分析MTA和MTB的相互作用与定位。
MTA调控ABA通路基因的机制验证
验证MTA是否通过m6A修饰直接调控ABA通路基因的mRNA稳定性和翻译效率。
在MTA RNAi和过表达果实中检测NCED5、ABAR、AREB1的m6A水平、基因表达、mRNA稳定性和翻译效率变化，并通过RIP验证MTA与这些转录本的结合。
MTA对翻译相关因子基因的调控分析
探究MTA是否通过调控翻译起始因子和延伸因子基因的m6A修饰和表达来间接影响翻译效率。
分析翻译起始因子（EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C）和延伸因子（EF1A）基因的m6A修饰、表达水平、mRNA稳定性，并通过RIP验证MTA与这些转录本的结合。
MTA RNAi果实全局m6A甲基化组分析
明确MTA对全局m6A mRNA甲基化的必要性及对成熟相关基因的调控作用。
对MTA RNAi果实和对照果实进行m6A-seq和RNA-seq分析，鉴定差异m6A peaks及表达变化，并进行GO富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| m6A-seq | 植物RNA提取试剂盒 | Magen | R4165-02 |
| Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Life Technologies | 61006 | |
| 抗m6A多克隆抗体 | Synaptic Systems | 202003 | |
| RNA酶抑制剂 | Promega | N2112S | |
| Dynabeads蛋白A | Life Technologies | 10002A | |
| N6-甲基腺苷 | TargetMol | T6599 | |
| NEBNext超RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530 | |
| Illumina HiSeq X测序仪 | Illumina | -- | |
| 定量RT-PCR | 植物RNA提取试剂盒 | Magen | R4165-02 |
| HiScript® III RT SuperMix定量PCR试剂盒 | Vazyme | R323-01 | |
| ChemQ通用SYBR定量PCR预混液 | Vazyme | Q711-02-AA | |
| StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| SELECT分析 | Bst 2.0 DNA聚合酶 | NEB | M0537S |
| SplintR连接酶 | NEB | M0375S | |
| mRNA稳定性 | QuikChange II XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200518 |
| LC-MS/MS | 核酸酶P1 | Wako | 145-08221 |
| 碱性磷酸酶 | Sigma-Aldrich | P6774 | |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| 三重四极杆质谱仪 | Waters | -- | |
| 腺苷 | TargetMol | T0853 | |
| RNA免疫沉淀 | 抗GFP单克隆抗体 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 04693132001 | |
| 蛋白酶K | Takara | 9034 | |
| 亚细胞定位 | Leica共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| LCI实验 | 化学发光成像系统 | Tanon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| m6A-seq和RNA-seq | 草莓果实发育阶段（S6, RS1, RS3）及MTA RNAi/对照果实的采样时间，生物学重复数（3），样本混合数量（≥60个果实） 阅读提示：Methods: m6A-seq and data analysis；Methods: Plant materials |
| m6A-IP-qPCR | 抗m6A抗体用量（5 μg），起始mRNA量（5 μg），片段化条件，内参基因 阅读提示：Methods: m6A-IP-qPCR |
| mRNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（20 μg/mL），处理时间（0, 3, 6小时），烟草叶片或草莓果实切片制备方法 阅读提示：Methods: mRNA stability assay |
| 翻译效率实验 | 多聚核糖体提取缓冲液成分，离心条件（200,000g, 4小时），内参基因（GADPH2） 阅读提示：Methods: Translation efficiency assay |
| 农杆菌介导的瞬时转化 | 草莓果实品种及发育阶段（八倍体'Benihoppe'大绿期），农杆菌菌株（GV3101），菌液OD600（0.8），注射后培养条件（23°C，80%湿度，16/8小时光周期），培养时间（5-7天） 阅读提示：Methods: Agroinfiltration-mediated transient transformation in strawberry fruit |
| Y2H实验 | 酵母菌株（AH109），载体（pGADT7, pGBKT7），筛选培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade） 阅读提示：Methods: Y2H analysis |
| LCI实验 | 农杆菌菌株（GV3101），OD600（0.5），注射后培养时间（36小时），荧光素底物浓度（1 mM） 阅读提示：Methods: LCI assay |
| LC-MS/MS | mRNA起始量（200 ng），酶解条件，标准品浓度 阅读提示：Methods: Quantitative analysis of m6A level by LC-MS/MS |