验证内含子读数的RNA来源
验证prime-seq文库中的内含子读数来源于RNA而非基因组DNA污染。
将小鼠基因组DNA和人RNA按不同比例混合，进行DNase I处理或不处理，构建prime-seq文库并测序，通过比对到小鼠和人基因组来计算来源于基因组DNA的UMI比例。
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Prime-seq：高效且强大的批量RNA测序
Prime-seq, efficient and powerful bulk RNA sequencing
实验完整度
高包含多重独立验证：与TruSeq基准比较、gDNA污染实验、RNA提取方法比较、低输入量验证、条形码交换评估及实际应用示例。
主要模型
HEK293T细胞系 人诱导多能干细胞(iPSC)及其神经祖细胞(NPC)分化 患者来源异种移植(PDX)的急性髓系白血病(AML)细胞 小鼠胚胎干细胞(mESC)
重点核对
DNase I处理有效性：通过混合小鼠gDNA和人RNA进行验证 与TruSeq性能比较：使用UHRR和ERCC参考RNA RNA提取方法比较：硅胶柱vs羧基磁珠 低输入量验证：1000个细胞(~10-20 ng总RNA) 条形码交换水平：人-小鼠混合实验
摘要
早期条形码标记实现的经济高效的文库构建一直是推动单细胞RNA测序的关键。在此，我们优化并验证了prime-seq，一种早期条形码标记的批量RNA测序方法。我们证明其性能与标准批量RNA测序方法TruSeq相当，但由于文库成本降低近50倍，其成本效益高出四倍。我们还验证了直接RNA分离步骤，表明内含子读数来源于RNA，并比较了现有方案的成本效益。我们得出结论，prime-seq是目前建立早期条形码标记批量RNA测序方案的最佳选择之一，许多实验室将从中受益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何优化并验证一种集成了单细胞RNA测序早期条形码标记、模板转换和UMI等技术的批量RNA测序方法，使其在性能上与标准方法TruSeq相当的同时，具有更高的成本效益和灵敏度？
- 核心机制
- prime-seq采用poly(A)引物、模板转换、早期条形码标记和UMI生成3'端标记的RNA-seq文库。内含子读数来源于RNA而非基因组DNA，可用于基因表达定量。磁珠法RNA提取与柱法产生不同但复杂度相似的表达谱。
- 主要证据
- 通过MAQC-III基准比较，prime-seq在检测基因数、准确度(ERCC相关性R2=0.94)和统计功效上与TruSeq相当，但文库成本降低近50倍，每个样品成本$2.53。通过人-鼠混合实验验证DNase I消化完全且内含子读数源于RNA。
- 研究意义
- 作者认为prime-seq是目前建立早期条形码标记批量RNA测序方案的最佳选择，其成本效益允许在固定预算下增加样本量，从而提高检测差异表达基因的统计功效，提升实验设计的灵活性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
与TruSeq基准方法比较性能
在文库复杂度、准确度和统计功效方面，定量比较prime-seq与标准批量RNA测序方法TruSeq的性能。
使用与MAQC-III研究相同的UHRR和ERCC参考RNA混合物，但输入量降低1000倍，构建8个prime-seq文库，测序深度至少3000万reads。使用zUMIs流程处理数据，并与MAQC-III的TruSeq数据进行比较。
比较磁珠法与柱法RNA提取
评估使用羧基磁珠代替硅胶柱进行RNA提取对prime-seq文库质量和成本效益的影响。
从HEK293T细胞、人PBMC和小鼠脑组织中提取RNA，分别使用硅胶柱试剂盒(Direct-zol)和羧基磁珠进行提取。比较两种方法构建的prime-seq文库的read分布、基因表达谱、检测基因数和相关成本。
验证低输入量敏感性
验证prime-seq在低输入RNA量下的性能，确定其最小适用样本量。
从1000个(~10-20 ng总RNA)和10,000个(~100-200 ng) HEK293T细胞中提取RNA，构建prime-seq文库，比较两个条件的文库复杂度、UMI数和检测基因数，以及表达谱的相关性。
评估条形码交换水平
量化prime-seq中因PCR过程中嵌合分子形成导致的条形码交换水平。
分别或混合构建来自小鼠胚胎干细胞(mESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)的prime-seq文库。通过将reads比对到人和小鼠基因组来评估交叉污染水平。
展示实际应用
通过两个实际应用场景展示prime-seq的灵敏度和高通量优势。
应用一：对94个冷冻保存的AML-PDX患者样本进行表达谱分析，使用1-mm活检打孔器取样不融化样本。应用二：将5个人iPSC系分化为NPC，并对已知标记基因进行表达分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Direct-zol RNA MicroPrep试剂盒 | Zymo | R2062 |
| DNeasy Blood & Tissue试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| RLT Plus裂解液 | Qiagen | 1053393 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| SpeedBeads磁珠 | Sigma-Aldrich | GE65152105050250 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | TH.Geyer | L0102 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10500-064 | |
| 青霉素 | Thermo Fisher | -- | |
| 链霉素 | Thermo Fisher | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher | 25200072 | |
| 细胞计数 | 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | 15-250-061 |
| 纽鲍尔计数板 | -- | -- | |
| RNA提取 | 蛋白酶K | Thermo Fisher | AM2546 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fisher | EN0525 | |
| cDNA合成 | Maxima H-逆转录酶 | Thermo Fisher | EP0753 |
| Maxima H-缓冲液 | Thermo Fisher | -- | |
| 脱氧核苷三磷酸 | Thermo Fisher | -- | |
| 模板转换寡核苷酸 | IDT | -- | |
| 条形码标记oligo(dT)引物 | IDT | -- | |
| 外切酶I | Thermo Fisher | EN0581 | |
| cDNA扩增 | KAPA HiFi预混液 | Roche | 7958935001 |
| SingV6引物 | IDT | -- | |
| 文库构建 | NEBNext Ultra II FS文库制备试剂盒 | NEB | E6177S |
| prime-seq接头 | IDT | -- | |
| SPRI-select磁珠 | Beckman Coulter | B23317 | |
| Q5预混液 | NEB | M0544L | |
| i7 Index引物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| i5 Index引物 | IDT | -- | |
| 文库构建（早期版本） | Nextera XT试剂盒 | Illumina | FC-131-1096 |
| P5NextPT5引物 | IDT | -- | |
| i7 index引物 | IDT | -- | |
| 文库质控 | Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | Thermo Fisher | P11496 |
| 安捷伦2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 高灵敏度DNA分析试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| 文库构建（早期版本） | 琼脂糖E-Gel EX | Invitrogen | G401002 |
| Monarch DNA凝胶回收试剂盒 | NEB | T1020 | |
| 测序 | Illumina HiSeq 1500测序仪 | Illumina | -- |
| NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞处理 | Bambanker细胞冻存液 | NIPPON Genetics | BB01 |
| 样本制备 | RNAse Away | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 异氟烷 | Abbot | TU | |
| 1-mm活检打孔器 | Kai Medical | BPP-20F | |
| 钢刀片 | Wilkinson Sword | -- | |
| NPC分化 | GMEM培养基 | Thermo Fisher | -- |
| 敲除血清替代物 | Thermo Fisher | -- | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher | -- | |
| A-83-01 | Sigma-Aldrich | -- | |
| LDN 193189 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Y27632 | biozol | -- | |
| Accumax | Sigma-Aldrich | -- | |
| Geltrex基质胶 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA定量 | QuantiFlour RNA染料 | Promega | E3310 |
| 对照试剂 | ERCC Mix 1 | Thermo Fisher | 4456740 |
| 通用人参考RNA | Thermo Fisher | QS0639 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Prime-seq文库构建 | 起始细胞数（1000-10,000），蛋白酶K浓度（20 μg），DNase I处理条件（1单位，20°C 10分钟），逆转录条件（42°C 90分钟），PCR循环数（5-15） 阅读提示：Methods: Prime-seq |
| gDNA污染验证 | 小鼠gDNA与人RNA的比例（75%, 50%, 25%, 0%），DNase I处理与否，文库数量（每个条件3个重复） 阅读提示：Methods: gDNA priming experiment |
| 与TruSeq性能比较 | RNA输入量（1000倍稀释的MAQC-III Mix A），文库数量（8个），测序深度（至少3000万reads） 阅读提示：Methods: MAQC-III comparison experiment |
| RNA提取方法比较 | 样本类型（HEK293T、PBMC、小鼠脑组织），RNA提取方法（柱法vs磁珠法），蛋白酶K消化条件（50°C 15分钟，75°C 10分钟） 阅读提示：Methods: RNA extraction experiments |
| 条形码交换评估 | RNA量（0.5-128 ng），PCR循环数（9-17），物种类型（人类和小鼠） 阅读提示：Methods: Barcode swapping experiments |