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优化的靶向RNA的CRISPR/Cas13d技术在鉴定功能性circRNA方面优于shRNA
Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs
摘要
短发夹RNA（shRNA）通常用于通过靶向反向剪接位点来消耗circRNA。然而，shRNA介导的circRNA敲低与其相应的生物学效应之间经常存在差异，这对其稳健性提出了质疑。通过利用CRISPR/Cas13d工具并优化针对circRNA反向剪接位点的单导RNA设计策略，我们显著增强了circRNA沉默的特异性。这种特异性在shRNA和CRISPR/Cas13d文库的并行筛选中得到了验证。使用靶向超过2500个人肝细胞癌相关circRNA的CRISPR/Cas13d筛选文库，我们随后鉴定出了一组索拉非尼耐药circRNA。因此，CRISPR/Cas13d代表了高通量研究功能性circRNA的有效方法。
实验方法
产品清单
| 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|
| StepOnePlus™ 实时PCR系统 | Applied Biosystems | StepOnePlus |
| SpectraMax iD3 多功能酶标仪 | -- | iD3 |
| Illumina NextSeq 测序仪 | Illumina | NextSeq |
| Illumina MiSeq 测序仪 | Illumina | MiSeq |
| Illumina Hiseq 测序仪 | Illumina | Hiseq |
| Millipore 0.45 μm PVDF滤膜 | Millipore | 0.45 μm |
| NuPAGE 4–12% 梯度凝胶 | Thermo Fisher | 4–12% |
| DIG Northern印迹起始试剂盒 | Roche | -- |
| RiboMAX 大规模RNA生产系统 | Promega | Large Scale |
| SuperScript IV 逆转录酶 | Invitrogen | IV |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 2000 |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 2000 |
| NEBuilder HiFi DNA组装主混合物 | NEB | #E2621 |
| PureLink™ HiPure 质粒大提试剂盒 | Thermo Fisher | K210007 |
| SybrGreen反应混合物 | Applied Biosystems | -- |
| CCK-8试剂盒 | Abcam | ab228554 |
| RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 索拉非尼 | Selleck Chemicals | S7397 |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc7392 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 |
| RNase R酶 | Epicenter | -- |
| 重组RNasin核糖核酸酶抑制剂 | -- | -- |
| T7 RNA聚合酶 | -- | -- |
| 福尔马林 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- |
| 乙酸 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- |
| CustomArray 合成平台 | CustomArray | -- |
| Endura电转感受态细胞 | -- | -- |