circRNA注释与选择
鉴定肝细胞癌中高表达且保守的circRNA作为候选靶标
使用CIRCexplorer2分析20例HCC患者的RNA-seq数据，筛选出134个高表达circRNA，其中20个在鼠中保守，选择top10进行验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
优化的RNA靶向CRISPR/Cas13d技术在鉴定功能性circRNA方面优于shRNA
Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs
实验完整度
高包含细胞实验、CRISPR/Cas13d和shRNA文库筛选、RNA-seq、体内体外模型及功能验证，证据层级丰富。
主要模型
Huh7细胞 PLC/PRF/5细胞 HCT116细胞 HEK293T细胞
重点核对
gRNA间隔序列长度：24nt CasRx稳定表达的Huh7细胞 shRNA和gRNA文库慢病毒感染，MOI约0.3 嘌呤霉素筛选浓度：2μg/ml 索拉非尼处理浓度：2.5μM
摘要
短发夹RNA（shRNA）被用于通过靶向反向剪接连接（BSJ）位点来消耗circRNA。然而，shRNA介导的circRNA敲低与相应的生物学效应之间经常存在差异，这质疑了其稳健性。通过利用CRISPR/Cas13d工具并优化针对circRNA BSJ位点的单向导RNA设计策略，我们显著提高了circRNA沉默的特异性。这种特异性在shRNA和CRISPR/Cas13d文库的平行筛选中得到验证。使用靶向超过2500个人肝细胞癌相关circRNA的CRISPR/Cas13d筛选文库，我们随后鉴定了一组索拉非尼耐药的circRNA。因此，CRISPR/Cas13d代表了一种高通量研究功能性circRNA的有效方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现circRNA的特异性敲低并准确鉴定功能性circRNA？
- 核心机制
- CRISPR/Cas13d系统通过碱基配对识别RNA，24nt间隔序列的gRNA可高效特异性地切割circRNA，降低脱靶效应。
- 主要证据
- 通过优化gRNA长度和错配敏感性实验，以及平行shRNA和Cas13d文库筛选，证明Cas13d具有更低的脱靶率和更高的特异性；并验证了circCNIH4和circFMNL2的敲低可增敏索拉非尼治疗。
- 研究意义
- 该研究提供了一种可靠的高通量circRNA功能筛选平台，有助于理解circRNA在疾病中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
shRNA介导的circRNA敲低
评估shRNA敲低circRNA的效率及对细胞增殖的影响
针对每个circRNA设计两个shRNA，转导Huh7细胞后检测敲低效率和细胞增殖。
LNA介导的circRNA敲低
验证shRNA敲低结果的可靠性
使用LNA GapmerR靶向circASPH，检测敲低效率和细胞增殖。
CRISPR/Cas13d系统优化
确定最佳gRNA间隔序列长度以提高敲低效率和特异性
构建不同长度间隔序列的gRNA（21-30nt，以及30、35、40nt），检测靶向circRNA的敲低效率；通过错配实验评估特异性。
Cas13d与shRNA特异性比较
比较CRISPR/Cas13d和shRNA在circRNA敲低中的特异性
使用位置匹配的gRNA和shRNA靶向circEGFP，进行RNA-seq分析脱靶效应。
平行功能筛选
系统比较Cas13d和shRNA文库在鉴定必需circRNA方面的能力
构建靶向134个circRNA的shRNA和gRNA文库，在Huh7细胞中进行14天增殖筛选，通过MAGeCK分析鉴定负选circRNA。
验证已知功能性circRNA
评估Cas13d系统能否验证已报道的必需circRNA的功能
使用Cas13d敲低circRHOT1、circHIPK3和CDR1as，检测其对增殖或靶基因表达的影响。
大文库筛选索拉非尼耐药circRNA
鉴定抑制后能增敏索拉非尼治疗的circRNA
构建靶向2543个circRNA的Cas13d文库，在Huh7细胞中进行索拉非尼药物筛选，鉴定显著耗竭的gRNA对应的circRNA，并验证其功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰酶-EDTA | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 反转录 | SuperScript IV逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green | Applied Biosystems | -- |
| StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 体外转录 | RiboMAX大规模RNA生产系统 | Promega | -- |
| RNase R处理 | RNase R | Epicenter | -- |
| 蛋白质印迹 | NuPAGE Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher | -- |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc7392 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 抗Histone H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Abcam | ab228554 |
| 药物处理 | 索拉非尼 | Selleck Chemicals | S7397 |
| 质粒构建 | lentiGuide-Puro载体 | Addgene | 52963 |
| pLKO.1-TRC载体 | Addgene | 10878 | |
| EF1a-CasRx (无NLS)-2A-EGFP载体 | Addgene | 109049 | |
| gRNA骨架载体 | Addgene | 109053 | |
| pre-gRNA骨架载体 | Addgene | 109054 | |
| 文库构建 | NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | NEB | E2621 |
| PureLink™ HiPure质粒大提试剂盒 | Thermo Fisher | K210007 | |
| 慢病毒包装 | pMD2.G包装质粒 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| 细胞分选 | 流式细胞分选 | -- | -- |
| 测序 | Illumina NextSeq测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系和培养基：Huh7、PLC/PRF/5、HCT116等使用DMEM+10%FBS；HepG2和Hep3B使用MEM；SNU系列使用RPMI1640；37°C，5% CO2；细胞来源ATCC。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| gRNA设计 | gRNA间隔序列长度24nt；设计位置应覆盖BSJ位点并含错配以减少脱靶；预实验验证敲低效率。 阅读提示：Results: Optimization of CRISPR/Cas13d system; Methods: shRNA and gRNA library design |
| 慢病毒感染 | MOI约0.3；使用HEK293T细胞包装；转染试剂Lipofectamine 2000；感染后嘌呤霉素筛选浓度2μg/ml。 阅读提示：Methods: Lentivirus preparation and transduction |
| 细胞增殖实验 | 接种密度（Huh7和PLC/PRF/5：4×10^4/孔；HCT116：3×10^4/孔）于12孔板；培养6天；结晶紫染色；CCK-8实验接种3×10^3/96孔。 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay |
| 索拉非尼处理 | 索拉非尼浓度2.5μM；DMSO作为对照；每2-3天换液；处理时间14天（筛选）或4个月（耐药细胞）。 阅读提示：Methods: Drug treatment |