构建Rabep2基因敲除小鼠模型
验证Rabep2缺失对侧支血管和梗死体积的影响。
使用CRISPR-Cas9技术删除Rabep2外显子3的55个核苷酸，生成纯合敲除小鼠。
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使用小鼠体内评估平台的跨物种方法证明人类RABEP2的序列变异调节缺血性卒中结果
A cross-species approach using an in vivo evaluation platform in mice demonstrates that sequence variation in human RABEP2 modulates ischemic stroke outcomes
实验完整度
高实验包含基因敲除小鼠模型、AAV基因拯救、体外细胞迁移与VEGFR2定位、体内侧支血管和梗死体积测量，以及分子动力学模拟，多个独立层级验证。
主要模型
Rabep2基因敲除小鼠（C57BL/6J） 人微血管内皮细胞（HMEC-1） AAV介导的基因拯救小鼠模型
重点核对
Rabep2 KO小鼠的构建方法（CRISPR-Cas9删除外显子3） AAV注射剂量（至少2×10^13 vg/mL）及注射时间（P1） pMCAO手术时间点（12±1周）及梗死测量时间（24小时） 侧支血管计数时间点（P21和10周） 细胞迁移实验的siRNA处理浓度（10 μM）和观察时间点（0,4,8,10小时）
摘要
Ischemic stroke, caused by vessel blockage, results in cerebral infarction, the death of brain tissue. Previously, quantitative trait locus (QTL) mapping of cerebral infarct volume and collateral vessel number identified a single, strong genetic locus regulating both phenotypes. Additional studies identified RAB GTPase-binding effector protein 2 (Rabep2) as the casual gene. However, there is yet no evidence that variation in the human ortholog of this gene plays any role in ischemic stroke outcomes. We established an in vivo evaluation platform in mice by using adeno-associated virus (AAV) gene replacement and verified that both mouse and human RABEP2 rescue the mouse Rabep2 knockout ischemic stroke volume and collateral vessel phenotypes. Importantly, this cross-species complementation enabled us to experimentally investigate the functional effects of coding sequence variation in human RABEP2. We chose four coding variants from the human population that are predicted by multiple in silico algorithms to be damaging to RABEP2 function. In vitro and in vivo analyses verify that all four led to decreased collateral vessel connections and increased infarct volume. Thus, there are naturally occurring loss-of-function alleles. This cross-species approach will expand the number of targets for therapeutics development for ischemic stroke.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类RABEP2编码序列变异是否影响缺血性卒中结局，如梗死体积和侧支血管数量？
- 核心机制
- RABEP2通过调节VEGFR2的细胞表面定位和内体循环，影响侧支血管形成，从而调节缺血性卒中后的梗死体积。
- 主要证据
- 在小鼠模型中，人和小鼠RABEP2均能拯救Rabep2 KO表型；四个编码变体在细胞迁移、VEGFR2定位及体内侧支血管和梗死体积方面功能受损，其中p.Arg543His为无效等位基因。
- 研究意义
- 该跨物种方法扩展了缺血性卒中治疗靶点的数量，为开发针对人类RABEP2变异的疗法提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Rabep2缺失的表型
确认Rabep2缺失是否导致侧支血管减少和梗死体积增加。
比较WT、Het和KO小鼠的侧支血管数量和pMCAO后梗死体积。
AAV介导的基因拯救实验
验证外源Rabep2或RABEP2能否恢复敲除表型。
向P1小鼠脑内注射AAV载体（CMV启动子表达EGFP、小鼠Rabep2或人RABEP2），在3和10周测量侧支血管，12周时进行pMCAO测量梗死体积。
人RABEP2编码变体的体外功能评估
评估四个编码变体对细胞迁移和VEGFR2细胞表面定位的影响。
在HMEC-1细胞中用siRNA敲低内源RABEP2，再感染表达野生型或变异RABEP2的AAV，进行划痕实验和细胞膜生物素化实验。
人RABEP2编码变体的体内功能评估
评估四个编码变体对侧支血管数量和梗死体积的影响。
将表达各变异RABEP2的AAV注射入Rabep2 KO小鼠，测量侧支血管数量和pMCAO后的梗死体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AAV9-CMV-EGFP-WPRE | -- | -- |
| AAV9-CMV-Rabep2-P2A-EGFP-WPRE | -- | -- | |
| AAV9-CMV-RABEP2-P2A-EGFP-WPRE | -- | -- | |
| 侧支血管测量 | PU4ii | VasQtec | -- |
| 免疫组织化学 | 抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | -- | |
| 细胞培养 | HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 |
| MCDB-131培养基 | -- | -- | |
| 细胞功能实验 | siRNA | Dharmacon | D-001910-10-05 |
| RABEP2特异性siRNA | Dharmacon | M-009001-01-0005 | |
| 细胞膜生物素化 | EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | Thermo Fisher Scientific | A44390 |
| 免疫印迹 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗RABEP2抗体 | Proteintech Group | 14625-1-AP | |
| 抗VEGFR2抗体 | Cell Signaling Technology | 2479 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| ECL检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 图像采集 | Panorama Midi II扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| 图像分析 | Image-Pro软件 | Media Cybernetics | -- |
| Fiji (ImageJ) | -- | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | Rabep2 KO小鼠的构建方法（CRISPR-Cas9删除外显子3），年龄匹配（P21、10周、12±1周），性别（雄性和雌性） 阅读提示：Material and methods - Animals |
| AAV注射 | AAV载体构建（pAAV9-CMV-...），注射体积（1 μL），最小滴度（2×10^13 vg/mL），注射时间（P1），注射部位（右半球） 阅读提示：Material and methods - Viruses |
| 侧支血管测量 | 灌注缓冲液成分（腺苷1 mg/mL、罂粟碱40 μg/mL、肝素25 mg/mL），聚氨酯溶液（1:1树脂与2-丁酮），测量时间（P21和10周） 阅读提示：Material and methods - Collateral vessel density measurement |
| pMCAO手术 | 麻醉剂量（氯胺酮100 mg/kg，甲苯噻嗪5 mg/kg），手术细节（钻孔位置、电凝），术后温度维持（37°C），环境温度（25°C） 阅读提示：Material and methods - pMCAO |
| 梗死体积测量 | 测量时间（pMCAO后24小时），TTC染色浓度（2%），切片厚度（1 mm），染色时间（20分钟） 阅读提示：Material and methods - Infarct volume measurement |
| 细胞实验 | HMEC-1培养条件（MCDB-131培养基，5% CO2，37°C），siRNA浓度（10 μM），感染时间（48小时），划痕实验观察时间点（0, 4, 8, 10小时） 阅读提示：Material and methods - Cell culture, In vitro scratch assay |
| 免疫印迹 | 裂解缓冲液成分（50 mM Tris-HCl pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.2% Triton X-100），上样量（30-50 μg），一抗浓度（1:1000，anti-GFP、anti-RABEP2等） 阅读提示：Material and methods - Immunoblot analysis |