全外显子组测序和遗传分析
在MMAF患者队列中鉴定潜在的致病基因变异。
对90名MMAF中国男性进行全外显子组测序，并通过Sanger测序验证CFAP58变异，分析其致病性和遗传模式。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CFAP58双等位基因功能缺失变异导致人类和小鼠鞭毛轴丝及线粒体鞘缺陷和弱畸形精子症
Bi-allelic Loss-of-function Variants in CFAP58 Cause Flagellar Axoneme and Mitochondrial Sheath Defects and Asthenoteratozoospermia in Humans and Mice
实验完整度
高涵盖全外显子组测序、精子形态与超微结构分析、免疫荧光/免疫印迹验证，并通过CRISPR/Cas9小鼠模型进行体内功能验证。
主要模型
90名MMAF中国男性队列 人类精子样本 Cfap58基因敲除小鼠
重点核对
CFAP58双等位基因功能缺失变异，包括纯合或复合杂合突变 精子形态分析（H&E染色，至少200个精子/样本） 透射电子显微镜（TEM）观察鞭毛轴丝和线粒体鞘超微结构 免疫荧光和免疫印迹检测CFAP58、SPAG6、SPEF2、HSP60蛋白表达 Cfap58基因敲除小鼠的生育力测试和精子表型分析
摘要
精子鞭毛多发形态异常（MMAF）是一种严重的弱畸形精子症。尽管近期的研究已揭示多个MMAF相关基因，并证明MMAF是一种遗传异质性疾病，但至少三分之一的病例病因仍不清楚。在本研究中，我们通过全外显子组测序在90名MMAF中国男性队列中的5名（5.6%）无血缘关系的个体中鉴定出CFAP58双等位基因功能缺失变异。每位携带CFAP58双等位基因变异的男性均表现出典型的MMAF表型。透射电子显微镜显示存在明显的鞭毛缺陷，包括轴丝和线粒体鞘畸形。CFAP58主要在睾丸中表达，编码一种纤毛和鞭毛相关蛋白。免疫荧光分析显示，CFAP58定位于对照精子整个鞭毛，并主要集中在中段。免疫印迹和免疫荧光分析显示，携带CFAP58双等位基因变异的男性精子中，轴丝超微结构标志物SPAG6和SPEF2以及线粒体鞘蛋白HSP60的丰度显著降低。我们通过CRISPR/Cas9技术生成了Cfap58基因敲除小鼠。雄性小鼠不育，并表现出严重的鞭毛缺陷，与MMAF患者的精子表型一致。总之，我们在人类和小鼠中的发现强烈表明CFAP58在精子鞭毛形成中发挥重要作用，并证明CFAP58双等位基因功能缺失变异可导致轴丝和轴丝周围结构畸形，进而导致男性不育。这项研究为理解和咨询MMAF相关的弱畸形精子症提供了重要见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CFAP58双等位基因功能缺失变异是否与MMAF相关，并导致精子鞭毛缺陷和雄性不育？
- 核心机制
- CFAP58功能缺失导致精子鞭毛轴丝结构（如中央微管、外周微管）和线粒体鞘畸形，可能通过影响轴丝组装和线粒体鞘的形成，从而导致MMAF和雄性不育。
- 主要证据
- 在90名MMAF患者中发现5人携带CFAP58双等位基因功能缺失变异；患者精子显示轴丝中央微管和外周微管缺失、线粒体鞘畸形；SPAG6、SPEF2和HSP60表达显著下降；Cfap58敲除小鼠不育且精子鞭毛形态异常。
- 研究意义
- 本研究首次证明CFAP58双等位基因功能缺失变异是人类MMAF的遗传病因，为MMAF相关弱畸形精子症的遗传咨询和病因理解提供了重要依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
精子表型分析
评估CFAP58变异对精子形态和运动能力的影响。
收集患者精液，进行H&E染色和扫描电镜观察精子形态，分析精子浓度和运动力。
精子超微结构分析
观察CFAP58变异导致的鞭毛轴丝和线粒体鞘的超微结构缺陷。
透射电子显微镜观察精子鞭毛横截面和纵截面，分析轴丝微管、线粒体鞘和外周致密纤维的形态。
蛋白表达和定位分析
检测CFAP58及其相关蛋白在精子中的表达和定位情况。
使用免疫荧光和免疫印迹检测CFAP58、SPAG6、SPEF2、HSP60等在患者精子中的表达和定位。
Cfap58基因敲除小鼠模型建立和表型分析
在体内验证CFAP58功能缺失对精子发生和生育力的影响。
利用CRISPR/Cas9技术生成Cfap58基因敲除小鼠，进行精子形态、运动能力、生育力测试和睾丸组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子组测序 | SureSelect XT人全外显子捕获试剂盒 | Agilent | -- |
| 免疫印迹 | 抗CFAP58抗体 | Invitrogen | PA5-57714 |
| 抗HSP60抗体 | Abcam | ab13532 | |
| 抗SPEF2抗体 | Sigma | HPA040343 | |
| 免疫荧光 | 抗CFAP58抗体 | Invitrogen | PA5-65174 |
| 抗SPAG6抗体 | Sigma | HPA038440 | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma | T6793 | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5335 | |
| 免疫印迹 | 增强化学发光底物 | Biosharp | BL520A |
| 透射电子显微镜 | SPI-Chem树脂 | -- | -- |
| Epon 812环氧树脂 | -- | -- | |
| 扫描电子显微镜 | Nova Nano 450场发射扫描电子显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| 透射电子显微镜 | TecnaiG2 Spirit 120千伏冷冻电子显微镜 | -- | -- |
| 免疫荧光 | LSM 800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | -- |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 实时定量PCR | LightCycler 480 SYBR Green I Master混合物 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 遗传分析 | 外显子组捕获试剂盒、测序平台、序列比对软件版本 阅读提示：Materials and Methods - WES, Bioinformatic Analysis, and Sanger Sequencing |
| 精子形态分析 | 精液采集前禁欲时间、精液液化时间和温度、形态学分析样本量 阅读提示：Materials and Methods - Semen Parameters and Sperm Morphological Analysis |
| 超微结构分析 | 扫描和透射电子显微镜的制样方法、观察切片数量 阅读提示：Materials and Methods - Scanning and Transmission Electron Microscopy |
| 蛋白表达检测 | 抗体类型、稀释比例、孵育条件、样本用量 阅读提示：Materials and Methods - Immunoblotting and Immunofluorescence Assays |
| 动物模型验证 | sgRNA靶向序列、小鼠品系和年龄、交配实验设计 阅读提示：Materials and Methods - Generation of the Cfap58-KO Mouse Model and Mating Test |