进化基因组学分析
分析CIROZ在脊椎动物中的进化保守性和丢失模式
通过多序列比对、PhyloP保守性分析和跨物种基因组搜索，分析CIROZ在哺乳动物、鱼类、鸟类和爬行动物中的存在/缺失和ORF衰减。
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CIROZ在祖先进化脊椎动物中可有可无，但对人类左右模式形成至关重要
CIROZ is dispensable in ancestral vertebrates but essential for left-right patterning in humans
实验完整度
高包含人类患者遗传学、小鼠敲除模型、斑马鱼和爪蟾敲除/敲低模型、表达分析、蛋白结构预测及体外分泌实验等多层级验证。
主要模型
人类患者家庭队列（10个家庭） 小鼠（Ciroz敲除模型） 斑马鱼（ciroz敲除模型） 非洲爪蟾（ciroz敲除/敲低模型）
重点核对
人类CIROZ双等位基因失活变异与异位症的关联（10个家庭，16例患者） 小鼠Ciroz敲除导致内脏异位和心脏缺陷 斑马鱼ciroz敲除（Z和MZ）无左右模式缺陷 非洲爪蟾ciroz敲除/敲低无左右模式缺陷 CIROZ在小鼠、非洲爪蟾和斑马鱼LRO中的特异性表达
摘要
DAND5、PKD1L1、MMP21和CIROP四个基因构成一个遗传模块，该模块在左右组织器（LRO）中具有运动纤毛的脊椎动物物种中特异性进化。我们发现CIROZ（前称C1orf127）也在小鼠、青蛙和鱼的LRO中特异性表达，其编码的蛋白质具有信号肽和3个透明带N结构域，与细胞外定位一致。我们报告了来自10个家庭的16个个体的CIROZ双等位基因失活变异，这些变异导致异位症伴先天性心脏缺陷。虽然小鼠中Ciroz的敲除也会导致内脏位置异常，但我们意外地发现其在斑马鱼和非洲爪蟾中的靶向失活不会导致可观察到的左右异常。此外，CIROZ在LRO具有运动纤毛的特定动物中缺失或功能退化，包括食肉目、银汉鱼总目鱼类或无颌脊椎动物。总之，这项进化发育生物学研究确定CIROZ是人类和小鼠打破胚胎双侧对称性的必需基因，而我们在离散的脊椎动物物种中见证了其当代的假基因化进程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CIROZ基因在脊椎动物左右模式形成中的作用及其进化保守性如何？
- 核心机制
- CIROZ编码一种含信号肽和三个ZP-N结构域的分泌蛋白，在LRO中特异性表达，对人类和小鼠打破胚胎双侧对称性至关重要，但在斑马鱼和非洲爪蟾中可有可无。
- 主要证据
- 人类遗传学分析发现16例异位症患者携带CIROZ双等位基因失活变异；小鼠Ciroz敲除模型显示内脏异位；斑马鱼和非洲爪蟾敲除模型无表型；进化基因组学分析显示CIROZ在多个脊椎动物分支中独立丢失或假基因化。
- 研究意义
- 该研究确定CIROZ是人类和小鼠左右模式形成的关键基因，并揭示了脊椎动物左右不对称建立机制的多样性，表明相关基因正在经历当代进化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人类遗传学研究
鉴定CIROZ变异与异位症的关联
对10个异位症家庭进行外显子组或基因组测序，鉴定CIROZ双等位基因失活变异，并通过Sanger测序验证，分析基因型-表型关联。
表达模式分析
确定Ciroz在LRO中的时空表达
利用整mount原位杂交和切片原位杂交检测斑马鱼、非洲爪蟾和小鼠胚胎中Ciroz的表达。
小鼠基因敲除验证
验证Ciroz敲除对小鼠左右模式的影响
分析两个现有的小鼠Ciroz敲除品系（Gm572b2b1167Clo和Gm572tm1b(EUCOMM)Hmgu）的表型。
斑马鱼基因敲除验证
验证ciroz敲除对斑马鱼左右模式的影响
通过CRISPR-Cas9产生ciroz敲除斑马鱼品系，分析心脏环化、肝脏/胰腺位置、lov和lefty2表达。
非洲爪蟾基因敲除/敲低验证
验证ciroz敲除或敲低对非洲爪蟾左右模式的影响
通过CRISPR-Cas9产生ciroz敲除（crispant）或使用吗啉代寡核苷酸敲低，分析心脏、肠道和胆囊位置。
蛋白结构预测与体外验证
解析CIROZ蛋白结构域并验证其分泌和寡聚化
利用HHpred和AlphaFold预测CIROZ结构，在HEK293T细胞中表达HA标记的CIROZ，通过Western blot分析分泌和寡聚化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | HyClone | SH30081.01 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | SH30070 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Scientific | 25030081 | |
| 细胞转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2312 |
| 细胞培养 | OptiMEM培养基 | Gibco | 31985070 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 04693159001 | |
| 分泌实验 | Pro293a-CDM无血清培养基 | Lonza | 12-764Q |
| Western blot | 蛋白质分子量标准 | Bio-Rad | 161–0377 |
| 4–20%梯度预制胶 | Bio-Rad Criterion | 567–1093 | |
| 0.2 μm PVDF膜 | Bio-Rad Criterion | 170–4157 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| 抗HA-HRP抗体 | Sigma | H6533 | |
| HRP底物 | Thermo Scientific SuperSignal | 34080/34076/34096 | |
| iBright FL1500成像系统 | Invitrogen | -- | |
| 小鼠原位杂交 | DIG RNA标记系统 | Roche | -- |
| BM-Purple AP底物 | Roche | -- | |
| Leica DM5000B显微镜 | Leica | -- | |
| SuperScript IV反转录酶 | Invitrogen | -- | |
| 非洲爪蟾实验 | MEGAshortscript T7试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| 带核定位信号的Cas9蛋白 | PNA Bio | -- | |
| 翻译阻断吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools | -- | |
| 剪接阻断吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools | -- | |
| 斑马鱼实验 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| mMESSAGE mMACHINE试剂盒(SP6) | Ambion | -- | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| iScript试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Power SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 统计分析 | GraphPad PRISM 10 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人类遗传学研究 | CIROZ双等位基因失活变异的鉴定与异位症表型的关联；患者的临床表型 阅读提示：Results部分“Bi-allelic CIROZ loss-of-function variants lead to HTX in humans”及图2 |
| 小鼠Ciroz敲除 | 两个敲除品系的遗传背景、基因型、表型评估方法 阅读提示：Results部分“Inactivation of Ciroz in mice validates and models the human disease” |
| 斑马鱼ciroz敲除 | CRISPR-Cas9靶位点（外显子6）、产生的等位基因类型（lof1, lof2, lof3）、Z型和MZ型突变体、心脏环化/肝脏/胰腺位置/侧向基因表达评估 阅读提示：Results部分“Targeted inactivation of ciroz in zebrafish does not reveal laterality phenotypes”及图5 |
| 非洲爪蟾ciroz敲除/敲低 | CRISPR-Cas9靶位点（内含子2和11）、TBMO/SBMO序列和剂量、器官位置评估 阅读提示：Results部分“Targeted inactivation of ciroz in Xenopus does not cause HTX”及图4 |
| 表达分析 | 原位杂交的胚胎阶段、探针序列、表达模式 阅读提示：Results部分“Ciroz is specifically expressed by cells of the ciliated LRO in zebrafish, Xenopus, and mice”及图3 |