构建HDR荧光报告系统
建立用于筛选和量化HDR活性的报告系统
构建了包含EGFP基因（缺失起始密码子）的HDR报告载体，将靶向序列和PAM/TAM克隆至上游，通过慢病毒转导至HEK293T细胞，经杀稻瘟菌素筛选建立稳定细胞系。
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紧凑型RNA引导核酸酶的定向进化以增强其在哺乳动物细胞中的活性
Directed evolution of compact RNA-guided nucleases for enhanced activity in mammalian cells
实验完整度
高研究包含多层级验证：体外细胞系（HEK293T、NIH-3T3、Hepa 1-6）编辑测定、原代T细胞实验、小鼠体内AAV递送实验，以及功能验证（碱基编辑、体内）等，证据相互独立。
主要模型
HEK293T细胞系 HEK293T HDR报告细胞系 原代人T细胞 C57BL/6J小鼠 Hepa 1-6细胞系
重点核对
HEK293T HDR报告细胞系中HDR效率的测量 HEK293T、NIH-3T3、Hepa 1-6细胞中内源基因编辑效率的测量 原代人T细胞中内源基因编辑效率的测量 AAV9递送后小鼠肝脏编辑效率和血清PCSK9水平 脱靶效应评估
摘要
背景
RNA引导的核酸酶能够实现DNA编辑，并在治疗遗传疾病方面具有前景，尤其是在精确序列替换方面。然而，许多最有效的酶，如化脓性链球菌Cas9，体积过大，无法使用腺相关病毒等载体进行递送。这促使人们对来自Cas12f和TnpB家族的更小替代品产生兴趣。然而，这些核酸酶在哺乳动物细胞中的活性通常较低，限制了其应用。
结果
我们在人类细胞中使用定向进化来选择活性显著提高的变体。所得的变体Cas12f1Super和TnpBSuper在不增加脱靶效应的情况下，编辑效率提高了多达11倍。当作为碱基编辑器测试时，Cas12f1Super相对于先前工程化的CasMINI显示出高达10倍的改进，表明其效用不仅限于核酸酶相关活性。
结论
这些紧凑高效的基因组编辑器扩展了目前的工具箱，并有望在哺乳动物系统中用于研究和治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过定向进化提高紧凑型RNA引导核酸酶在哺乳动物细胞中的编辑活性？
- 核心机制
- 通过哺乳动物细胞内的定向进化筛选出多个突变组合，这些突变可能通过增强与核酸的相互作用或改善与哺乳动物细胞环境的兼容性来提高编辑活性，但具体机制尚待进一步研究。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞、原代人T细胞和小鼠模型中，Cas12f1Super和TnpBSuper较亲本酶显著提高了HDR和NHEJ效率，且未增加脱靶效应。
- 研究意义
- 这些紧凑高效的基因组编辑器扩展了现有工具箱，为哺乳动物系统的研究和治疗应用提供了潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
进行定向进化筛选
通过多轮筛选富集高活性变体
通过易错PCR构建突变文库，经慢病毒递送、HDR筛选、FACS分选富集活性变体，并进行多轮筛选。
鉴定和组合活性突变
确定能够提高HDR活性的关键突变并组合成高效变体
对筛选后的变体进行单突变体和组合突变体测试，在多个报告位点和内源位点验证活性，并利用结构指导的还原策略优化突变组合。
评估内源位点编辑效率
验证进化变体在内源基因组位点的编辑效率提升
将Cas12f1Super和TnpBSuper与相应sgRNA/ωRNA共递送至HEK293T细胞，通过ampliconNGS检测HDR和NHEJ效率。
评估原代T细胞编辑效率
评估进化变体在临床相关的原代T细胞中的编辑效率
将TnpBSuper mRNA与合成ωRNA和ssODN共电转至激活的原代人T细胞，检测HDR和NHEJ效率。
评估体内编辑效率
评估进化变体在小鼠肝脏中的编辑效率和PCSK9蛋白水平变化
将Cas12f1Super/TnpBSuper包装至AAV9，通过尾静脉注射至C57BL/6J小鼠，在6周后检测肝脏编辑效率和血清PCSK9水平。
验证脱靶效应
评估进化变体是否会增加脱靶效应
使用DISCOVER-Seq技术检测CasMINI/Cas12f1Super和TnpB/TnpBSuper在HEK293T细胞中的脱靶位点。
验证碱基编辑功能
评估进化变体作为碱基编辑器的性能
构建dCas12f1Super-TadA*融合蛋白，与sgRNA共递送至HEK293T细胞，检测腺嘌呤碱基编辑效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 含GlutaMAX的DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| MycoAlert试剂盒 | Lonza | -- | |
| 原代T细胞分离 | EasySep™人T细胞富集试剂盒 | StemCell Technologies | -- |
| T细胞活化 | 抗CD3抗体（OKT3克隆） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗CD28抗体（CD28.2克隆） | BioLegend | -- | |
| T细胞培养 | 白细胞介素-7 | -- | -- |
| 白细胞介素-15 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 文库构建 | GeneMorph II试剂盒 | Agilent | -- |
| 电穿孔 | Lonza Amaxa 4D核转染仪 | Lonza | -- |
| 基因组DNA提取 | Gentra Puregene细胞试剂盒 | Qiagen | -- |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria Fusion | BD | -- |
| BD FACSAria III | BD | -- | |
| mRNA合成 | mMESSAGE mMACHINE™ T3转录试剂盒 | Thermo Fisher | AM1348 |
| mRNA纯化 | Monarch离心RNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | T2050L |
| mRNA定量 | Qubit RNA广谱定量试剂盒 | Thermo Fisher | Q10210 |
| T细胞电转 | 合成ωRNA | Synthego | -- |
| 脂质转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白质免疫印迹 | 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 荧光二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32213 | |
| Odyssey CLx扫描仪 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 测序文库制备 | Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| DISCOVER-Seq | MRE11抗体 | Thermo Fisher | PA3-16527R |
| 甲醛 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白A Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| MinElute试剂盒 | Qiagen | -- | |
| NEBNext Ultra II工作流程 | New England BioLabs | -- | |
| 蛋白纯化 | His6-GFP-2xNLS-CasMINI/Cas12f1Super | -- | -- |
| Ni-NTA Superflow树脂 | Qiagen | -- | |
| HiTrap SP HP柱 | Cytiva | -- | |
| Amicon Ultra-15离心过滤装置 | Merck | -- | |
| Superdex 200凝胶柱 | GE Healthcare | -- | |
| 体外转录 | TranscriptAid T7高产转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| GeneJET RNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体外切割实验 | 质粒DNA（pTK1910或pTK1911） | -- | -- |
| 凝胶分析 | GelAnalyzer软件 | -- | -- |
| AAV生产 | Qubit 3.0荧光计 | Invitrogen | -- |
| 血清分析 | 小鼠前蛋白转化酶9/PCSK9 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 质粒构建 | Gibson组装 | New England Biolabs | -- |
| Q5 DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HEK293T、NIH-3T3、Hepa 1-6细胞系来源、培养条件（DMEM+10%FBS+1%双抗）、支原体检测、传代次数限制 阅读提示：Methods：Cell culture |
| HDR报告细胞系构建 | 报告载体构建、慢病毒转导时MOI（Target CM1为6，其他为0.2）、杀稻瘟菌素筛选浓度（6 μg/mL）和持续时间（3周） 阅读提示：Methods：HDR reporter cell line generation |
| 定向进化筛选 | 文库大小（CasMINI 1.5×10^7，TnpB 4.5×10^7）、诱变率（每个ORF约2个氨基酸突变）、筛选轮次（4轮）、FACS分选门控策略 阅读提示：Methods：Cloning variant libraries、Workflow for HDR-enriched variant selection |
| 内源基因编辑 | 质粒递送比例1:1、电转细胞数1-2×10^5、ssODN用量100 pmol、电转程序（SF buffer/DG-130）、检测时间（3天） 阅读提示：Methods：Electroporation of mammalian cells、Amplicon next-generation sequencing |
| 原代T细胞编辑 | T细胞来源、激活方法（anti-CD3/CD28）、电转参数（1×10^6细胞、150 pmol ωRNA、4 μg mRNA、200 pmol ssODN）、电转后处理时间 阅读提示：Methods：Cell culture、Electroporation of mammalian cells |
| 体内实验 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（6周）、AAV剂量（5×10^13 vg/kg）、注射方式（尾静脉）、取材时间点（3周和6周） 阅读提示：Methods：Mouse studies |
| 脱靶检测 | 转染方案（2×10^7细胞，120 μg质粒）、交联条件（1%甲醛，15分钟）、测序深度（每样本4000万 reads） 阅读提示：Methods：DISCOVER-Seq |