无菌小鼠代谢物测定
评估在无微生物组条件下循环吲哚和酚类代谢物的水平。
测量无菌和SPF小鼠血清中代谢物浓度，并喂食纯化饮食以排除饮食干扰，使用LC-MS检测代谢物。
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宿主代谢独立于微生物组产生多种吲哚和酚类代谢物
Host metabolism can produce many indoles and phenols independently of the microbiome
实验完整度
高该研究包含体外细胞培养、小鼠及大鼠模型、临床样本分析等多个独立实验层级，并通过稳定同位素示踪、基因敲除和生化实验进行了功能和机制验证。
主要模型
小鼠模型 大鼠模型 HCT116细胞 临床样本分析
重点核对
无菌小鼠与SPF小鼠的血清代谢物浓度比较 2小时和36小时13C-氨基酸输注与抗生素处理 HCT116细胞13C-氨基酸示踪及转氨酶抑制实验 小鼠肝组织匀浆的体外酶活测定 患者血清中抗生素存在与否与代谢物水平的相关性
摘要
吲哚和酚类代谢物通常被认为是细菌消化色氨酸（吲哚）和苯丙氨酸或酪氨酸（酚类）的产物。控制肠道微生物产生这些代谢物的兴趣日益增长，因为它们具有重要的生理影响，吲哚激活芳烃受体信号，酚类与健康体重相关。尽管关于哪些细菌产生这些代谢物的研究越来越多，但宿主对其循环池的贡献尚未被表征。在这里，通过细胞培养、小鼠和大鼠中的稳定同位素示踪，我们表明哺乳动物细胞可以独立于微生物组产生芳基丙酮酸、芳基乳酸、芳基乙酸和芳基羧酸。我们证明这些代谢物在小鼠和人类患者中的循环水平对微生物组的扰动是稳健的。相比之下，细菌代谢是合成芳基丙酸和游离吲哚、苯酚和对甲酚所必需的。总的来说，这些结果表明宿主代谢是循环吲哚和酚类代谢物池的主要贡献者。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主自身代谢是否对循环吲哚和酚类代谢物有贡献，以及这些代谢物的来源如何区分于微生物组。
- 核心机制
- 哺乳动物细胞通过转氨酶（如GOT1）将芳香族氨基酸转化为相应的芳基丙酮酸，再经脱氢等反应生成芳基乳酸、芳基乙酸等产物，而芳基丙酸及游离吲哚、苯酚等需要微生物组参与。
- 主要证据
- 稳定同位素示踪显示2小时内宿主源性代谢物被标记而微生物组依赖性代谢物未被标记；无菌小鼠和抗生素处理小鼠中宿主源性代谢物水平不变；HCT116细胞和肝匀浆生化实验证实了相关酶活性。
- 研究意义
- 该发现表明宿主代谢是循环吲哚和酚类代谢物的重要来源，影响疾病治疗策略的制定，提示需重新评估微生物组相关研究中的因果推论。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
2小时13C-氨基酸输注
追踪仅宿主代谢产生的代谢物。
对颈静脉插管小鼠输注13C-色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸2小时，检测血清和粪便中代谢物的标记。
抗生素处理下的36小时输注
区分宿主和微生物组来源的代谢物。
用广谱抗生素处理小鼠14天，并在最后36小时输注13C-氨基酸，检测血清中代谢物的标记，并与未处理组比较。
13C-蛋白喂养实验
评估饮食蛋白经微生物组发酵产生的代谢物对循环池的贡献。
给小鼠喂食含13C藻蛋白的纯化饮食，24小时后收集门静脉血清和盲肠内容物，检测代谢物的标记。
细胞培养示踪
测试哺乳动物细胞是否自主产生吲哚和酚类代谢物。
在HCT116及其他细胞系培养基中添加13C-氨基酸，24小时后检测代谢物的标记，并用氨基氧乙酸抑制转氨酶验证。
组织匀浆生化测定
鉴定参与代谢的酶和反应条件。
在小鼠肝或细胞裂解液中添加底物和辅因子，测定转氨酶、脱氢酶等活性，并通过蛋白分离纯化和蛋白质组学寻找关键酶。
临床数据关联分析
验证宿主源性代谢物在人类抗生素暴露下保持稳定。
分析波士顿儿童医院和AML患者样本，比较有或无抗生素检测到的情况下的代谢物水平，并关联粪便微生物多样性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 代谢物测量 | Orbitrap Exploris 240 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 液相色谱 | XBridge BEH Amide色谱柱 | Waters | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ATCC | -- |
| RPMI培养基 | ATCC | -- | |
| Countess II 血细胞计数器 | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Invivogen | -- | |
| 微生物组DNA提取 | Power Soil DNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| PCR扩增 | LongAmp Taq 2X预混液 | New England Biolabs | M0287L |
| DNA纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| DNA定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Life Technologies | Q32854 |
| 纳米孔测序 | 牛津纳米孔MinION测序仪 | Oxford Nanopore | -- |
| qPCR | PerfeCTa SYBR Green预混液 | QuantaBio | -- |
| 饮食 | 13C藻蛋白 | Sigma-Aldrich | 642878 |
| 大米蛋白分离物 | NAKED Supplements | -- | |
| 组织匀浆 | KIMBLE Dounce组织研磨器套装 | Sigma-Aldrich | DWK885300-0000 |
| 细胞裂解 | 高压均质机 | Avestin | -- |
| 体外活性测定 | 天冬氨酸转氨酶1（猪心来源） | Sigma-Aldrich | 9000-97-9 |
| 蛋白质分级分离 | HiPrep 16/60 Sephacryl S 200 HR色谱柱 | Cytiva | -- |
| HiTrap Capto Q ImpRes阴离子交换柱 | Cytiva | -- | |
| HiTrap Capto SP ImpRes阳离子交换柱 | Cytiva | -- | |
| HiTrap脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| Amicon Ultra-15超滤管 | Merck Millipore | -- | |
| 代谢物标准品 | 氘代苯甲酸 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-122 |
| 氘代吲哚-3-乙酸 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8040 | |
| 13C-氨基酸 | 13C9-苯丙氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2250-H |
| 13C9-酪氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CNLM-439-H | |
| 13C11-色氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-4290-H | |
| 细胞处理 | 氨基氧乙酸 | Sigma-Aldrich | C13408 |
| 测序 | Illumina HiSeq平台 | Illumina | -- |
| 蛋白质组学 | Bruker TimsTOF Pro 2质谱仪 | Bruker | -- |
| nanoElute液相色谱 | Bruker | -- | |
| 代谢物测量 | 安捷伦1290 Infinity II液相色谱系统 | Agilent | -- |
| 安捷伦6470三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- | |
| Orbitrap IQ-X质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠代谢物浓度测量 | 无菌小鼠与SPF小鼠的品系、性别、周龄、饮食和饲养条件；样本采集时间 阅读提示：Methods: Germ-free mouse model; Fig. 1a,b |
| 同位素输注 | 13C-氨基酸种类、浓度、输注速率和持续时间；小鼠品系、体重、导管类型 阅读提示：Methods: 2 h and 36 h infusions |
| 抗生素处理 | 抗生素组合、浓度、处理时间；饮食中抗生素添加方式 阅读提示：Methods: 36 h infusion with antibiotics; Fig. 1e,f |
| 细胞培养示踪 | 细胞系、培养基、13C-氨基酸浓度和处理时间；转氨酶抑制剂浓度 阅读提示：Methods: Cell culture; Figure legends for Fig. 4 |
| 组织裂解物酶活测定 | 组织来源、缓冲液、底物和辅因子浓度、反应时间和温度；重复数 阅读提示：Methods: In vitro activity assays; Extended Data Fig. 7 |
| 临床数据关联分析 | 患者队列、抗生素检测标准、代谢物测量方法、统计检验 阅读提示：Methods: Boston Children's dataset, AML patient samples; Fig. 6 |