胚孔唇移植实验
测试M. leidyi胚胎胚孔唇是否具有诱导次级结构的能力。
将供体胚孔唇或侧外胚层组织移植到同期宿主胚胎的侧方，观察是否形成次级咽和口。
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栉水母的胚孔组织者
A blastoporal organizer in a ctenophore
实验完整度
高包含体内移植实验、跨门移植、药理学抑制、mRNA过表达、原位杂交及统计建模等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Mnemiopsis leidyi胚胎 Nematostella vectensis胚胎
重点核对
移植组织的来源（胚孔唇或侧外胚层）及移植位置（宿主侧方或囊胚腔） 抑制剂浓度和处理时间（iCRT14 10 μM；SB431542 30-40 μM；A83-01 2-15 μM） mRNA注射剂量和注射时间（0.35 µg/µl，受精卵或8细胞期） 分析时间点（M. leidyi 2天，N. vectensis 58小时） 统计模型（二项广义线性混合模型）
摘要
1924年，Hilde Mangold和Hans Spemann进行了一项标志性实验，证明两栖动物胚胎的背侧胚孔唇具有组织者功能，移植到宿主胚胎后可诱导产生次级体轴。这一发现表明特定的胚胎区域能够调控胚胎模式形成，并引导整个体轴的建立。后续研究表明，刺胞动物作为两侧对称动物的姐妹群，也拥有胚孔胚胎组织者。然而，组织者的演化起源仍不清楚。在此，我们报道栉水母Mnemiopsis leidyi的胚孔唇具有组织者活性，该物种属于所有其他后生动物的演化姐妹群。我们显示，从M. leidyi原肠胚移植的胚孔唇组织片段可诱导次级咽和口形成。此外，跨门移植实验表明，M. leidyi的胚孔唇可在刺胞动物Nematostella vectensis的胚胎中诱导产生次级体轴。M. leidyi中的组织者功能需要β-catenin和TGFβ信号传导，而TGFβ家族配体可能提供这种诱导能力。这些发现揭示了栉水母、刺胞动物和脊椎动物中胚孔组织者的深层同源性，暗示胚孔唇具有祖先组织者角色。我们提出，组织者的出现是一项关键创新，促进了从单细胞近缘种的时序细胞分化向第一个多细胞胚胎的空间细胞分化的转变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胚孔组织者的演化起源是什么？它是否存在于栉水母中，并可能出现在所有后生动物的共同祖先中？
- 核心机制
- M. leidyi的胚孔组织者功能依赖于β-catenin和TGFβ-SMAD2/3信号通路，其中TGFβ配体可能提供诱导信号，并且Brachyury基因作为下游效应因子连接上游信号与形态发生程序。
- 主要证据
- 移植M. leidyi胚孔唇可诱导次级咽和口形成，且移植组织与宿主细胞共同构成诱导结构；跨门移植可诱导N. vectensis中NvFoxA异位表达；药理学抑制和配体过表达实验证实了信号通路的作用。
- 研究意义
- 该研究表明胚孔组织者是后生动物的祖先特征，其出现可能促进了从单细胞祖先的时序细胞分化到多细胞胚胎的空间细胞分化的转变。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
跨门移植实验
测试M. leidyi胚孔唇是否能诱导其他动物门类的轴形成。
将M. leidyi胚孔唇移植到N. vectensis原肠胚的囊胚腔，通过原位杂交检测NvFoxA的表达。
信号通路抑制实验
检验β-catenin和TGFβ信号在组织者发育和诱导中的作用。
用iCRT14、CHIR99021、SB431542和A83-01处理胚胎，观察表型及Brachyury等基因表达变化。
TGFβ配体过表达实验
验证TGFβ配体是否足以诱导异位口部结构。
将编码M. leidyi TGFβ配体的mRNA注射到M. leidyi受精卵或N. vectensis 8细胞期胚胎中，观察表型及NvFoxA表达。
Wnt配体表达实验
检验M. leidyi Wnt配体是否能诱导异位轴。
在N. vectensis胚胎中过表达M. leidyi WntA、Wnt6、Wnt9和WntX，观察是否诱导异位轴。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎培养 | 红海盐 | Red Sea Fish Pharm | -- |
| RGcomplete | Reef Nutrition | -- | |
| 胚胎移植 | 羽毛无菌微型手术刀15度 | Feather Safety Razor | 72045-15 |
| 胚胎标记 | FM4-64FX | Invitrogen | F34653 |
| FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| 药理学处理 | A83-01 | MedChemExpress | HY-10432A |
| SB431542 | Sigma-Aldrich | S4317 | |
| iCRT14 | Sigma-Aldrich | SML0203 | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| 原位杂交 | MEGAscript SP6转录试剂盒 | Invitrogen | AM1330 |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| 封闭试剂 | Roche Diagnostics | 11096176001 | |
| NBT | Roche Diagnostics | 11383213001 | |
| BCIP | Roche Diagnostics | 11383221001 | |
| mRNA显微注射 | pCRII载体 | -- | -- |
| SP6 mMESSAGE mMACHINE试剂盒 | Invitrogen | AM1340 | |
| 荧光葡聚糖-Alexa594 | Invitrogen | D22913 | |
| 气动PicoPump显微注射器 | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Laboport N86 KT.18泵 | -- | -- | |
| 显微针TW100F-4 | World Precision Instruments | -- | |
| P-2000拉针仪 | Sutter Instrument | -- | |
| 4孔板 | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Axiovert 100倒置显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Wnt表达实验 | pCRII-EF1α载体 | -- | -- |
| I-SceI大范围核酸酶 | New England Biolabs | R0694S | |
| 肌动蛋白染色 | 鬼笔环肽-AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 显微镜成像 | 卡尔蔡司AxioImager.M2荧光显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- |
| pco.panda 4.2相机 | Excelitas PCO | -- | |
| 尼康Eclipse 80i显微镜 | Nikon | -- | |
| 尼康DS-Fi1相机 | Nikon | -- | |
| Axioscope 5显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- | |
| Axiocam 503彩色相机 | Carl Zeiss Microscopy | -- | |
| 卡尔蔡司LSM 980共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- | |
| 统计分析和图像处理 | Fiji v.2.14.0软件 | -- | -- |
| R v.4.6.0软件 | R Foundation for Statistical Computing | -- | |
| readxl v.1.4.5包 | -- | -- | |
| dplyr v.1.2.1包 | -- | -- | |
| lme4 v.2.0-1包 | -- | -- | |
| broom.mixed v.0.2.9.6包 | -- | -- | |
| emmeans v.2.0.1包 | -- | -- | |
| 微软Excel (Microsoft 365) | Microsoft | -- | |
| Adobe Photoshop 2026 | Adobe | -- | |
| Adobe Illustrator 2026 | Adobe | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物培养 | M. leidyi培养温度（17-19°C）、盐度（27.5 ppt）、光周期（19-5）、喂食频率；N. vectensis培养条件（16% ASW, 18°C, 暗处） 阅读提示：Methods: Animal culture |
| 移植实验 | 移植供体组织类型（胚孔唇或侧外胚层）、供体阶段（约4小时受精后）、宿主阶段、移植位置（侧方或囊胚腔）、宿主伤口的尺寸（约30 μm深、40 μm长） 阅读提示：Methods: Transplantation experiments; Extended Data Fig. 1 |
| 药理学处理 | 抑制剂浓度和处理时间（iCRT14 10 μM至8小时；CHIR99021 2.5 μM至8或24小时；SB431542 30-40 μM；A83-01 2-15 μM）、DMSO对照、开始处理阶段（2-4细胞期） 阅读提示：Methods: Pharmacological treatments; Extended Data Figs. 4, 5 |
| 原位杂交 | 探针浓度（0.5 ng/ml）、杂交温度（58°C）、蛋白酶K消化条件（80 μg/ml, 40秒） 阅读提示：Methods: In situ hybridization |
| mRNA显微注射 | mRNA浓度（0.35 µg/µl）、注射体积（约3-5 pl）、注射阶段（受精卵或8细胞期） 阅读提示：Methods: mRNA microinjections |
| Wnt表达实验 | 质粒浓度（50 ng/µl）、I-SceI浓度（0.2 U/µl）、注射阶段（8-16细胞期） 阅读提示：Methods: WNT ligand expression in N. vectensis embryos |
| 统计设计 | 生物学重复定义（独立产卵或收集）、主要终点（M. leidyi: 完整次级咽形成；N. vectensis: 异位NvFoxA表达）、显著性水平（α=0.05）、GLMM模型设置 阅读提示：Methods: Statistical analysis |