3D病理组织处理
对FFPE组织进行脱蜡、荧光H&E类似物染色、光学透明化，以进行3D成像，并评估其对生物分子的影响。
从FFPE组织块中取出配对样本，一个作为对照，另一个进行3D病理处理：二甲苯室温脱蜡48小时，无水乙醇洗涤，70%乙醇（pH4）含10mM NaCl、1:100曙红和1:500 TO-PRO3染色48小时，乙基肉桂酸透明化2小时并储存2周。
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评估三维病理组织处理流程对下游分子分析的影响
Assessing the Effects of a 3-Dimensional (3D) Pathology Tissue-Processing Workflow on Downstream Molecular Analyses
实验完整度
高包含47对FFPE样本的体外模型比较，涵盖DNA/RNA提取、PCR、Sanger测序、RNA-seq和IHC等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
乳腺癌FFPE组织样本 前列腺癌FFPE组织样本 头颈癌FFPE组织样本
重点核对
样本类型：乳腺癌（17例）、前列腺癌（15例）、头颈癌（15例）FFPE组织，每例配对取相邻圆形样本（直径3mm，高1-5mm） 3D病理处理条件：二甲苯室温脱蜡48小时，70%乙醇（pH4）含10mM NaCl、1:100曙红和1:500 TO-PRO3染色48小时，乙基肉桂酸透明化2小时并储存2周 核酸提取：使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（Qiagen），提取后约1个月进行下游分析 DNA扩增：PCR检测GAPDH（228bp）和COL2A1（274bp），使用15ng DNA，2个技术重复 RNA扩增：RT-qPCR检测GAPDH（71bp和153bp），使用50ng RNA，2个技术重复
摘要
目的
非破坏性三维病理方法近年来已经出现，通过大幅增加组织成像的采样量并提供体积形态学背景，有望增强标准的二维组织病理学。另一个关键优势是组织保持完整，允许在成像后重新包埋，以进行潜在的长期存储和未来的组织学或分子分析。在此，我们旨在系统地评估3D病理方案对生物分子（包括DNA、RNA和蛋白质）的影响及其与下游检测的兼容性。
材料与方法
我们将先前优化的3D病理方案（涉及脱蜡、荧光H&E类似物染色、光学透明化和开放式光片显微镜）应用于乳腺癌、前列腺癌和头颈癌的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本。方案处理后，将组织重新包埋在石蜡中，并与未进行3D病理处理的配对FFPE对照进行比较。提取DNA和RNA并进行质量评估。通过管家基因的PCR和逆转录定量PCR（RT-qPCR）测试可扩增性。
结果
与对照相比，3D病理处理组的DNA和RNA的平均产量略有下降，片段化增加，但PCR扩增能力基本保留。PCR产物的Sanger测序确认了准确的序列测定，而总RNA测序表明全局转录组谱基本不变。常见生物标志物的免疫组织化学（IHC）染色产生可比较的信号，表明这些蛋白质在3D病理工作流程后得到保留。
结论
这些结果证明了将3D病理与下游分子分析相结合的基本可行性，为未来进一步探索3D病理与各种先进分子检测的整合提供了理由。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 3D病理组织处理流程（Path3D）是否影响FFPE组织中的DNA、RNA和蛋白质，并兼容下游分子和组织学检测？
- 核心机制
- 3D病理处理过程中长时间的脱蜡、染色和透明化步骤可能导致核酸的酶促降解、化学修饰或部分损失，从而降低核酸产量和完整性，但未显著改变全局转录组谱和蛋白质抗原性。
- 主要证据
- 基于47对FFPE组织样本，比较Path3D处理与对照，通过Qubit定量、TapeStation完整性分析、PCR、Sanger测序、RT-qPCR、总RNA测序和IHC染色，显示核酸纯度轻微下降、DNA和RNA产量分别降低24%和30%，完整性降低，但PCR扩增、Sanger测序和RNA测序性能基本保持，IHC染色信号可比较。
- 研究意义
- 本研究首次全面定量评估3D病理工作流程对临床标本下游分子分析的兼容性，表明非破坏性3D病理可整合到分子工作流程中，支持组织成像后进行长期存储和后续分子及组织学分析。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
石蜡重新包埋
将处理后的组织重新包埋，以模拟原始存档状态，并用于后续切片分析。
处理后的样本经无水乙醇洗涤后重新包埋于新的石蜡块中，每个样本切取10片10μm厚的卷曲用于核酸提取。
核酸提取和质量控制
评估3D病理处理对DNA和RNA产量、纯度和完整性的影响。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit提取DNA和RNA，使用NanoDrop和Qubit定量，使用TapeStation评估完整性（DIN和DV200）。
DNA扩增和测序
验证3D病理处理后的DNA是否可用于常规下游分子检测。
对管家基因GAPDH和COL2A1进行PCR扩增，产物经SPRI纯化、Qubit定量、D1000 ScreenTape分析，并进行Sanger测序以评估序列保真度。
RNA扩增和测序
验证3D病理处理后的RNA是否可用于RT-qPCR和转录组测序。
对GAPDH的71bp和153bp片段进行RT-qPCR，检测扩增效率；然后选择6对高DV200样本进行总RNA测序，评估转录组覆盖和相似性。
H&E和免疫组化
评估3D病理处理对组织形态和蛋白质标记物可检测性的影响。
对每个组织类型的3对样本进行H&E染色和特定标记物的IHC染色，由病理学家定性评估，并进行H&E颜色相似性的定量分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 3D病理处理 | 二甲苯 | -- | -- |
| 曙红 | Leica Biosystems | cat#3801615 | |
| TO-PRO3 | ThermoFisher Scientific | cat#T3605 | |
| 乙基肉桂酸 | -- | -- | |
| 核酸提取 | AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒 | Qiagen | -- |
| 核酸QC | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Qubit RNA Broad Range检测试剂盒 | -- | -- | |
| Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒 | -- | -- | |
| Qubit dsDNA Broad Range检测试剂盒 | -- | -- | |
| Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | -- | -- | |
| Agilent 4200 TapeStation | Agilent Technologies | -- | |
| DNA扩增 | DreamTaq热启动PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ABI QuantStudio5实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| D1000 DNA ScreenTape检测 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA扩增 | SuperScript III Platinum SYBR Green一步法试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DNA测序 | ABI 3730xl DNA分析仪 | Applied Biosystems | -- |
| RNA测序 | Illumina链特异性总RNA制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | ER抗体 | abcam | cat#ab16660 |
| HER2/neu抗体 | abcam | cat#ab16662 | |
| pan-cytokeratin抗体 | abcam | cat#ab7753 | |
| NKX3.1抗体 | Thermo Fisher Scientific | cat#35-9700 | |
| Leica BOND RX全自动研究染色机 | Leica Biosystems | -- | |
| BOND聚合物精炼检测系统 | Leica Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D病理组织处理 | 脱蜡时间（二甲苯室温48小时）、染色液成分（70%乙醇pH4含10mM NaCl、1:100曙红、1:500 TO-PRO3）、透明化时间和储存条件（乙基肉桂酸2小时，储存2周） 阅读提示：Methods: 3D pathology tissue processing |
| 石蜡重新包埋 | 重新包埋的石蜡块中切取10片10μm厚卷曲用于核酸提取 阅读提示：Methods: Paraffin embedding |
| 核酸提取 | 使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（Qiagen）提取，提取时间在3D病理处理后约1个月 阅读提示：Methods: Nucleic acid extraction and quality control (QC) |
| DNA扩增 | PCR反应使用15ng DNA，两个技术重复；引物为GAPDH（Hs00828901_CE）和COL2A1（Hs00570192_CE） 阅读提示：Methods: DNA/RNA amplification tests |
| RNA扩增 | RT-qPCR使用50ng RNA，两个技术重复；引物序列见Methods；使用SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step Kit 阅读提示：Methods: DNA/RNA amplification tests |
| RNA测序 | 选择6对DV200较高的样本进行RNA测序；文库制备使用Illumina Stranded Total RNA Prep Kit；测序平台NovaSeq X Plus，PE150，约90-107百万读段 阅读提示：Methods: Total RNA sequencing and analysis |
| 免疫组化 | 每组3对样本；抗体稀释比：ER 1:100、HER2 1:100、pan-cytokeratin 1:300、NKX3.1 1:250；抗原修复条件：EDTA（乳腺10min，头颈20min）或柠檬酸（前列腺10min） 阅读提示：Methods: H&E and immunohistochemistry |