全基因组CRISPR筛选鉴定关键调节因子
在HNSCC细胞中系统性鉴定赋予铁死亡抵抗的基因。
使用GeCKO v2A敲除文库感染LIU-LSC-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，用DMSO或RSL3处理7天，通过sgRNA耗竭分析鉴定候选基因。
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TRAPPC4通过维持GPX4稳定性驱动头颈部鳞状细胞癌的铁死亡抵抗和肿瘤进展
TRAPPC4 Promotes GPX4 Stability to Drive Ferroptosis Resistance and Tumor Progression in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
实验完整度
高包含体外细胞实验、PDO、CDX、PDX、条件敲除小鼠及转移模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HNSCC细胞系（LIU-LSC-1、TU177等） 患者来源类器官（PDO） 细胞系来源异种移植瘤（CDX） 患者来源异种移植瘤（PDX） Trappc4条件敲除小鼠（4NQO诱导HNSCC模型） 淋巴结和肺转移模型
重点核对
全基因组CRISPR–Cas9筛选使用GeCKO v2A库，MOI=0.3，RSL3浓度2.5 µmol/L（IC20），处理7天 CDX模型使用BALB/c裸鼠，每只注射5×10^6细胞，RSL3剂量40 mg/kg腹腔注射，隔日一次 4NQO诱导HNSCC模型：4NQO饮水浓度100 μg/mL，处理16周，随后正常饮水10周 PDO药物处理：RSL3浓度10 µmol/L，PTV浓度20 µmol/L，处理48小时 PTV处理细胞浓度10 µmol/L，处理12小时
摘要
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）常在晚期被诊断，导致临床预后不良。铁死亡抵抗是HNSCC治疗的主要挑战，阐明HNSCC细胞逃逸铁死亡的机制至关重要。在本研究中，我们进行了全基因组CRISPR–Cas9敲除筛选，并鉴定出运输蛋白颗粒复合体亚基4（TRAPPC4）是HNSCC铁死亡抵抗的关键调节因子。在包括HNSCC细胞系、患者来源类器官、细胞系来源异种移植瘤、患者来源异种移植瘤、Trappc4条件敲除小鼠以及淋巴结和肺转移模型在内的一系列实验模型中，TRAPPC4通过抑制铁死亡促进肿瘤进展。机制上，TRAPPC4降低了TRIM55上游远端调控元件的染色质可及性，从而限制了FOS依赖的转录。这种抑制减少了TRIM55介导的GPX4泛素化和降解，导致GPX4稳定和铁死亡抵抗。基于结构的高通量虚拟筛选确定了匹伐他汀钙（PTV）作为TRAPPC4结合化合物，可促进TRAPPC4降解。值得注意的是，PTV钙与铁死亡诱导剂RSL3协同增强铁死亡活性并抑制HNSCC进展。这些发现描绘了驱动铁死亡抵抗和肿瘤进展的TRAPPC4–FOS–TRIM55–GPX4信号轴，并强调TRAPPC4是HNSCC中基于铁死亡干预的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HNSCC细胞如何逃逸铁死亡，以及这些机制是否可作为治疗靶点？
- 核心机制
- TRAPPC4通过降低TRIM55上游远端调控元件的染色质可及性，限制FOS依赖的转录，减少TRIM55介导的GPX4泛素化降解，从而稳定GPX4并赋予铁死亡抵抗。
- 主要证据
- 通过CRISPR筛选、多组学分析、体外细胞实验、PDO、CDX、PDX及条件敲除小鼠模型验证，发现TRAPPC4缺失增强铁死亡敏感性，而GPX4回补或TRIM55敲低可恢复表型。
- 研究意义
- 本研究揭示TRAPPC4–FOS–TRIM55–GPX4轴是HNSCC铁死亡抵抗和肿瘤进展的关键调节者，靶向TRAPPC4可能为基于铁死亡的HNSCC治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证TRAPPC4对铁死亡敏感性的影响
验证TRAPPC4是否调控HNSCC细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。
在LIU-LSC-1细胞中敲除TRAPPC4，在TU177细胞中过表达TRAPPC4，检测RSL3处理后的细胞活力、MDA、脂质ROS和线粒体形态。
体内CDX和PDO模型验证TRAPPC4功能
在体内和类器官模型中确认TRAPPC4对铁死亡抵抗和肿瘤进展的作用。
建立LIU-LSC-1 sgTRAPPC4 CDX模型，用RSL3处理；构建HNSCC PDO，敲低或过表达TRAPPC4后用RSL3处理，评估生长和铁死亡标志物。
条件敲除小鼠模型验证TRAPPC4功能
在自发性HNSCC模型中验证Trappc4缺失对铁死亡敏感性的影响。
通过Krt14-CreER诱导Trappc4条件敲除，用4NQO诱导HNSCC，然后给予RSL3或溶剂，分析舌部病变和淋巴结转移。
机制解析：TRAPPC4调控GPX4稳定性
确定TRAPPC4下游调控的分子机制。
通过蛋白质组学、RNA-seq、ATAC-seq和IP-MS鉴定TRIM55为关键靶标，验证TRIM55与GPX4的相互作用，检测GPX4的泛素化和降解。
转移模型评估TRAPPC4对转移的影响
评估TRAPPC4对HNSCC转移的影响及其与铁死亡的关系。
使用足垫-腘窝淋巴结和尾静脉肺转移模型，敲除TRAPPC4并给予铁死亡抑制剂Lip-1，评估转移能力。
虚拟筛选及药物验证
寻找靶向TRAPPC4的小分子化合物并验证其抗肿瘤效应。
对TRAPPC4进行基于结构的虚拟筛选，鉴定PTV为结合物，通过CETSA、DARTS、SPR验证结合，并评估PTV与RSL3的协同作用及体内抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选和鉴定关键基因
验证蛋白互作和翻译后修饰
评估药物结合和靶点验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药品和试剂 | RSL3 | MedChemExpress | HY-100218A |
| Ferrostatin-1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| Necrostatin-1 | MedChemExpress | HY-15760 | |
| Z-VAD-FMK | MedChemExpress | HY-16658 | |
| 巴佛洛霉素A1 | MedChemExpress | HY-100558 | |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY-17589A | |
| MG-132 | MedChemExpress | HY-13259 | |
| Liproxstatin-1 | MedChemExpress | HY-12726 | |
| Voxvoganan三盐酸盐 | MedChemExpress | HY-119123A | |
| VX-150 | MedChemExpress | HY-139346 | |
| 黄素腺嘌呤二核苷酸 | MedChemExpress | HY-B1654 | |
| 肽T | MedChemExpress | HY-P0272 | |
| 匹伐他汀钙 | MedChemExpress | HY-B0144 | |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus总RNA提取试剂 | Takara Bio | 9108 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒（含gDNA去除剂） | Takara Bio | RR037A |
| qPCR | TB Green预混液 | Takara Bio | RR820A |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | ST506 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Invitrogen | NP0316BOX | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ECL化学发光检测试剂盒 | New Cell & Molecular Biotech | P10300 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0038 |
| MDA检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010S | |
| 脂质ROS检测 | BODIPY 581/591 C11探针 | Invitrogen | D3861 |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 铁含量检测 | 铁检测试剂盒 | Abcam | ab83366 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-APC/碘化丙啶凋亡检测试剂盒 | KeyGEN | KGA1107-20 |
| LDH检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0017 |
| 转染 | Cloned Pfu DNA聚合酶 | Agilent Technologies | 600153 |
| 蛋白质互作 | 谷胱甘肽琼脂糖树脂 | GE Healthcare | 17-0756-05 |
| 药物靶点验证 | 链霉蛋白酶E | MedChemExpress | HY-114158A |
| SPR分析 | Biacore 8K系统 | Cytiva | -- |
| CM5传感芯片 | -- | -- | |
| 报告基因 | pGL3-promoter载体 | Promega | Addgene_212939 |
| Q5定点突变试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| pRL-TK质粒 | Promega | Addgene_11313 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| ChIP | SimpleChIP Plus酶解染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | #9003 |
| 抗FOS抗体 | Cell Signaling Technology | #2250 | |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903-01 |
| 抗FOS抗体 | Cell Signaling Technology | #2250T | |
| IP-MS | 免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2177M |
| PDO培养 | 癌症类器官基础培养基 | bioGenous | B213152 |
| 肿瘤组织消化液 | bioGenous | K601003 | |
| 红细胞裂解液 | bioGenous | E239010 | |
| 类器官培养ECM | bioGenous | M315066 | |
| PDO药物检测 | CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | GemPharmatech | -- |
| NOD/SCID小鼠 | GemPharmatech | IMSR_JAX:001303 | |
| 显微成像 | Pannoramic MIDI II数字切片扫描仪 | 3dhistech | -- |
| 测序平台 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 细胞系：LIU-LSC-1；MOI=0.3；嘌呤霉素筛选2 μg/mL，7天；RSL3浓度2.5 µmol/L，处理7天 阅读提示：Materials and Methods: Genome-wide CRISPR–Cas9 knockout library screens |
| 细胞培养 | 培养基：RPMI 1640（LIU-LSC-1）或DMEM（其他细胞系）；FBS浓度：20%（LIU-LSC-1）或10%；37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines and cell culture |
| 体外铁死亡实验 | RSL3浓度：4 µmol/L（常用）；处理时间：12小时；检测指标：细胞活力、MDA、脂质ROS 阅读提示：Materials and Methods: Cell viability assay, Malondialdehyde assay, Lipid ROS assay; Figure 1 legend |
| CDX模型 | 细胞系：LIU-LSC-1或TU177；接种细胞数：5×10^6；小鼠品系：BALB/c裸鼠；RSL3剂量：40 mg/kg i.p.隔日一次；处理起始时间：移植后第14天 阅读提示：Materials and Methods: In vivo tumor models; Figure 2 legend |
| PDO模型 | RSL3浓度：10 µmol/L；PTV浓度：20 µmol/L；处理时间：48小时；细胞活力检测：CellTiter-Glo 3D 阅读提示：Materials and Methods: PDO culture and drug testing; Figure 2 legend |
| 条件敲除小鼠模型 | 4NQO浓度：100 μg/mL饮水，16周；他莫昔芬剂量：120 mg/kg i.p.隔日一次共3次；RSL3剂量：40 mg/kg i.p.隔日一次，从第24周开始持续2周 阅读提示：Materials and Methods: Conditional knockout mice model; Figure 3 legend |
| 转移模型 | 细胞接种：足垫5×10^6，尾静脉1×10^6；Lip-1剂量：5 mg/kg i.p.隔日一次，共15次 阅读提示：Materials and Methods: In vivo tumor models; Figure 7 legend |
| PTV处理 | 细胞实验浓度：10 µmol/L，处理12小时；动物实验剂量：10 mg/kg i.p.隔日一次 阅读提示：Materials and Methods: Cell viability assay, In vivo tumor models; Figure 8 legend |