基因组和转录组图谱分析
鉴定BRAFV600E和RAS驱动甲状腺癌的突变特征和转录组特征。
对16例新鲜冻存组织进行WGS、bulk WTS和snRNA-seq，分析体细胞突变、拷贝数变异、基因融合和转录组表达。
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甲状腺癌中去分化轨迹与肿瘤-间质相互作用的突变特异性动态
Mutation-specific dynamics of dedifferentiation trajectories and tumor-stromal interactions in thyroid cancer
实验完整度
高基于16例肿瘤样本的多组学分析（snRNA-seq、WGS、WTS、空间转录组学），并结合体外验证（IHC）及公共数据集验证，涵盖基因、转录、空间和蛋白水平，功能验证较少但多层级证据充分。
主要模型
BRAFV600E突变甲状腺癌组织（PTC-B/ATC-B） RAS突变甲状腺癌组织（FTC-R/ATC-R） 患者来源组织样本（16例新鲜冻存，20例FFPE）
重点核对
样本量：16例新鲜冻存组织用于snRNA-seq/WGS/WTS，20例FFPE用于空间转录组学，96例组织芯片用于IHC 驱动突变：BRAFV600E vs RAS，分组为PTC-B/ATC-B/FTC-R/ATC-R 空间转录组平台：10x Visium（3例）和GeoMx DSP（15例） IHC验证：L1CAM、ITGAV、PLAU、PLAUR在肿瘤组织中的表达
摘要
从分化型甲状腺癌进展为未分化甲状腺癌（ATC）涉及深刻的上皮可塑性和肿瘤微环境（TME）重塑，但BRAFV600E和RAS驱动突变如何塑造这些过程仍不清楚。在这里，我们整合了单核RNA测序、空间转录组学和批量RNA测序，对BRAFV600E和RAS驱动的甲状腺肿瘤进行了分析，以描绘突变特异性的进展轨迹。BRAFV600E驱动的肿瘤表现出逐渐的去分化轨迹并伴有免疫通路激活，而RAS驱动的肿瘤则表现出以非整倍性、上皮-间质转化、缺氧和细胞外基质重塑为特征的突然转变。癌症相关成纤维细胞（CAFs）成为关键调节因子，具有突变特异性的配体-受体相互作用：整合素介导的信号在BRAFV600E突变的ATC中占主导，而PLAU-PLAUR、TNFSF10-TNFRSF10B和AREG-EGFR在RAS驱动的ATC中额外富集。这些CAF-上皮回路在空间上得到验证，并与不良预后相关。总之，我们的发现揭示了与甲状腺癌去分化相关的突变依赖性上皮和TME动态，并强调了分子定制方法在晚期甲状腺癌管理中的潜在重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRAFV600E和RAS驱动突变如何差异性地塑造甲状腺癌去分化轨迹及肿瘤微环境相互作用？
- 核心机制
- BRAFV600E驱动的肿瘤沿连续去分化轨迹进展并伴随免疫通路激活，RAS驱动的肿瘤发生突发性转变，涉及非整倍性、EMT、缺氧和ECM重塑；CAF通过突变特异性的配体-受体相互作用（如L1CAM-ITGAV、PLAU-PLAUR）促进肿瘤进展。
- 主要证据
- 整合snRNA-seq、空间转录组学和批量WTS分析，结合公共数据集，发现BRAFV600E和RAS驱动的ATC中CAF-上皮相互作用增强，并在空间、蛋白水平（IHC）验证关键配体-受体对。
- 研究意义
- 揭示了突变依赖性上皮和间质动态，强调分子定制方法在晚期甲状腺癌管理中的潜在重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞图谱绘制
解析肿瘤微环境中细胞类型组成和细胞状态。
对102,845个细胞进行单核RNA测序，鉴定五种主要细胞类型（肿瘤上皮、T/NK、髓系、成纤维细胞、内皮细胞），并分析细胞比例变化。
上皮细胞亚型鉴定
揭示去分化过程中的上皮细胞异质性和亚型。
对肿瘤上皮细胞进行无偏聚类，鉴定出7种上皮细胞亚型，基于TDS和ERK评分命名，并分析其分子特征和空间分布。
轨迹分析
推断去分化过程中的转录轨迹。
使用Monocle进行拟时间分析，构建BRAFV600E和RAS驱动的去分化轨迹，并分析沿轨迹的细胞亚型和通路变化。
细胞-细胞相互作用分析
鉴定上皮细胞与微环境细胞之间的相互作用。
使用CellPhoneDB分析配体-受体相互作用，并通过空间转录组学验证共定位。
蛋白表达验证
验证关键配体-受体蛋白在原位组织的表达。
通过免疫组化（IHC）检测L1CAM、ITGAV、PLAU和PLAUR在96例甲状腺组织中的表达，并评估其表达差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| WGS文库构建 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| Twist NGS文库制备试剂盒 | Twist Bioscience | -- | |
| WGS测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| WTS文库构建 | RNeasy小量提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| snRNA-seq文库构建 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | 1000268 |
| Chromium Next GEM G芯片单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000127 | |
| snRNA-seq测序 | S1试剂盒v1.5 | Illumina | -- |
| IHC | L1CAM抗体（小鼠单克隆） | Sigma-Aldrich | L4543 |
| ITGAV抗体（兔单克隆） | Abcam | ab179475 | |
| ITGB1抗体（兔单克隆） | Abcam | ab179471 | |
| PLAU抗体（小鼠单克隆） | OriGene | TA805243 | |
| PLAUR抗体（兔单克隆） | Abcam | ab218106 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集和分组 | 样本类型：16例新鲜冻存组织，20例FFPE；驱动突变（BRAFV600E vs RAS）；病理亚型（PTC-B/FTC-R/ATC-B/ATC-R） 阅读提示：Methods 'Subjects' 部分和Table S2 |
| WGS分析 | 测序平台：NovaSeq6000，150bp双端，平均覆盖率60×；比对参考基因组hg19；体细胞变异检测工具Mutect2；CNV检测工具CNVkit和FACETS 阅读提示：Methods 'WGS' 部分 |
| WTS分析 | RNA提取试剂盒：Qiagen RNeasy；文库制备：TruSeq Stranded mRNA；比对参考基因组GRCh38；差异表达分析edgeR 阅读提示：Methods 'Bulk WTS' 部分 |
| snRNA-seq分析 | 核分离方法；使用10x Genomics 3' kit v3.1；测序平台NovaSeq6000；数据过滤：基因数<300和线粒体含量>1%的细胞排除；批次校正Harmony；聚类Seurat 阅读提示：Methods 'snRNA-seq' 部分 |
| 空间转录组学（Visium） | 组织类型：FFPE；样本数：3例；分析流程：Spaceranger v1.3.0，参考基因组GRCh38-2020-A；去卷积GraphST；轨迹分析SPATA 阅读提示：Methods 'Spatial transcriptomics analysis (10x Visium)' 部分 |
| IHC验证 | 样本数：96例组织芯片；抗体浓度：L1CAM 1:1000，ITGAV 1:10000，ITGB1 1:10000，PLAU 1:300，PLAUR 1:250；评分标准：半定量0-3 阅读提示：Methods 'Immunohistochemistry on tissue array blocks' 部分 |