样本采集
收集有症状和无症状根尖周炎根管的微生物样本
从60颗牙齿的120个根管中采集微生物样本,每颗牙齿选择一个样本(测序深度最高者)
A Comparison of Endodontic Microbiomes Associated With Symptomatic and Asymptomatic Apical Periodontitis by Next-Generation Sequencing
横断面临床研究,包括样本采集、DNA提取、16S rRNA测序和多种统计分析方法,但无功能或机制验证。
临床牙齿样本 根管微生物样本
样本量:60颗牙齿(SAP n=30,AAP n=30) 诊断标准:临床和影像学(PAI≥3) 测序平台:Illumina MiSeq,V4区域 差异丰度分析方法:DESeq2、LinDA、ANCOM-BC2
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
收集有症状和无症状根尖周炎根管的微生物样本
从60颗牙齿的120个根管中采集微生物样本,每颗牙齿选择一个样本(测序深度最高者)
提取细菌DNA并制备16S rRNA V4区域测序文库
使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA,通过515F-Y和806R引物扩增V4区域,Nextera XT Index Kit添加接头和索引
对16S rRNA V4区域进行高通量测序
在Illumina MiSeq平台上使用MiSeq Reagent Kit v2进行500循环配对末端测序
处理测序数据并分析微生物组成和差异
使用Cutadapt进行接头修剪,DADA2推断ASV,eHOMD进行物种注释;使用phyloseq和vegan进行多样性分析,使用DESeq2、LinDA和ANCOM-BC2进行差异丰度分析
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | C-Pilot锉 | VDW | -- |
| K锉 | Dentsply Sirona | -- | |
| F6 SkyTaper | Komet | -- | |
| Safe-Lock离心管 | -- | -- | |
| Tris缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Endo冷喷 | Henry Schein | -- | |
| RayPex 6 | VDW | -- | |
| DNA提取 | QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | -- |
| DNA定量 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| 文库制备 | Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | -- |
| 测序 | MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | -- |
| MiSeq控制软件v2.6.2.1 | Illumina | -- | |
| 实时分析软件v1.18.54 | Illumina | -- | |
| 报告软件v2.6.3 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 纳入标准:临床和影像学诊断的根尖周炎,PAI≥3;排除标准;样本量n=30/组 阅读提示:Methods: 2.1, 2.2 |
| 微生物采样 | 采样方法:无菌锉单长度技术;样本保存条件 阅读提示:Methods: 2.3 |
| 测序 | 测序平台和试剂盒:Illumina MiSeq,MiSeq Reagent Kit v2 阅读提示:Methods: 2.4 |
| 生物信息学分析 | ASV推断方法:DADA2;分类数据库:eHOMD;过滤标准 阅读提示:Methods: 2.5 |
| 统计分析 | 多样性分析方法:Mann-Whitney U和PERMANOVA;差异丰度方法:DESeq2, LinDA, ANCOM-BC2;多重检验校正 阅读提示:Methods: 2.6 |