无饲养层培养条件初步筛选
评估不同细胞外基质蛋白及培养体系对牛扩展潜能干细胞在无饲养层条件下维持未分化状态的能力。
将bEPSCs从BFF饲养层转移至不同基质蛋白包被的培养板或含基质的培养基中，观察菌落形态和存活状态。测试了明胶、Matrigel、纤连蛋白、Geltrex和层粘连蛋白-521包被的二维培养，以及bEPSCM中添加Matrigel或Geltrex的三维样培养。
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一种无饲养层培养系统支持牛形成期胚胎干细胞的长时期扩增和生殖系能力
A feeder-free culture system supports long-term expansion and germline competence of bovine formative embryonic stem cells†
实验完整度
高包含无饲养层培养条件筛选、长期传代稳定性、多能性分子与功能验证（EB、畸胎瘤）、转录组分析、信号通路依赖性验证及PGCLC定向分化等独立证据层级。
主要模型
牛扩展潜能干细胞（bEPSCs） 无饲养层牛胚胎干细胞（FF-bESCs） BALB/c-nu裸鼠异种移植模型 牛原始生殖细胞样细胞（bPGCLCs）
重点核对
FF-bESCs在bEPSCM+Matrigel（高浓度）条件下可连续传代超过60代，且维持正常核型（2n=60） FF-bESCs表达核心多能性标志物OCT4、SOX2、NANOG，且不表达三胚层早期标志物（PAX6、TBXT、FOXA2） FF-bESCs在体外形成胚状体并分化出三胚层标志物（TUJ1、AFP、SMA），在体内形成含三胚层衍生物的畸胎瘤（形成效率80%） 转录组分析显示FF-bESCs与形成期bEpiSCs聚为一类，与bEPSCs和引发态bESCs区分明显 去除IWR1或Activin A后，FF-bESCs在4代内失去未分化形态，多能性基因下调，分化标志物上调
摘要
牛胚胎干细胞（bESCs）是细胞培养肉、大型动物基因编辑和胚胎-干细胞育种系统等下一代应用的基础。尽管最近已经建立了引发态bESCs和牛扩展潜能干细胞，但它们的常规维持通常依赖于小鼠胚胎成纤维细胞或牛胎儿成纤维细胞饲养层，这些饲养层复杂、劳动密集、标准化差，且不适合规模化生产。在此，我们报告了一种简化的无饲养层培养平台，用于bESCs，其中商业基础培养基与低生长因子Matrigel结合，生成三维、模拟微环境的底物。使用这种方法，我们成功衍生了一种新型的无饲养层bESCs（FF-bESCs），在不使用ROCK抑制剂的情况下可稳健扩增超过60代，同时保持正常核型、高增殖率和核心多能性标志物的稳定表达。功能测定证实FF-bESCs具有真正的多能性，表现为在体外形成胚状体并在体内生成包含所有三个胚层衍生物的畸胎瘤。转录组分析进一步揭示FF-bESCs与形成期多能状态对齐。值得注意的是，这些细胞可以被定向分化为原始生殖细胞样细胞。我们的无饲养层培养系统为推进基于bESC的技术在牛精准基因组编辑和生殖细胞分化以用于胚胎-干细胞育种系统中提供了可扩展、可重复的基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立一个无饲养层的培养系统来长期维持牛胚胎干细胞的多能性，并支持其向原始生殖细胞样细胞分化？
- 核心机制
- 在bEPSCM中添加Matrigel形成三维微环境，支持牛胚胎干细胞进入并维持形成期多能性状态；Wnt信号通路抑制和Activin A信号对维持FF-bESCs的多能性和自我更新至关重要。
- 主要证据
- 在无饲养层条件下，FF-bESCs可稳定传代超过60代，维持正常核型和高增殖率；表达核心多能性标志物；体外形成胚状体并分化为三胚层细胞，体内形成畸胎瘤；转录组分析显示其与形成期bEpiSCs相似；通过CRISPR/Cas9敲入TFAP2C-mCherry报告基因，并分化为表达PGC标志物的bPGCLCs。
- 研究意义
- 该无饲养层培养系统为牛胚胎干细胞提供了可规模化、标准化的扩增平台，可支持精确基因组编辑和体外配子发生，有望用于胚胎-干细胞育种系统，缩短世代间隔并加速遗传改良。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
长期培养及稳定性验证
验证FF-bESCs在无饲养层条件下的长期自我更新能力、增殖特性、克隆形成能力和核型稳定性。
在优化的bEPSCM+Matrigel（高浓度）体系中连续传代超过60次，进行群体倍增时间测定、单细胞克隆形成实验、核型分析，以及冷冻复苏后的恢复情况评估。
多能性验证
确认FF-bESCs在分子和功能上具备真正的多能性。
通过免疫荧光染色和RT-qPCR检测核心多能性标志物表达；通过胚状体形成实验和自发分化检测三胚层分化潜能；通过畸胎瘤形成实验验证体内多能性。
转录组分析揭示形成期多能性状态
通过转录组测序分析FF-bESCs的基因表达谱，确定其多能性状态及与已知牛胚胎干细胞系的关系。
对P5和P20的FF-bESCs以及BFF饲养层上的bEPSCs进行RNA-seq，进行相关性分析、PCA分析、差异表达基因鉴定和KEGG通路富集分析，并与已发表的引发态bESCs和形成态bEpiSCs及JY-bESCs进行比较。
信号通路依赖性验证
确定培养体系中各组分对维持FF-bESCs多能性和自我更新的必要性。
分别从培养基中移除IWR1、Activin A、CHIR99021、LIF、WH-4-023或维生素C，观察菌落形态变化，并通过RT-qPCR检测多能性和分化标志物表达。
向原始生殖细胞样细胞定向分化
评估FF-bESCs是否具备生殖系分化能力，并建立可追踪的PGCLC分化体系。
利用CRISPR/Cas9介导的同源重组将mCherry报告基因敲入TFAP2C基因座，建立TFAP2C-mCherry报告细胞系；然后进行预诱导和悬滴培养，诱导分化为bPGCLCs，并通过流式细胞术、RT-qPCR和免疫荧光检测PGC标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | TrypLE选择酶 | Gibco | 12563029 |
| mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| CHIR99021 | Selleck | S2924 | |
| WH-4-023 | Selleck | S7565 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| 维生素C | Sigma | 49752 | |
| 激活素A | R&D Systems | 338-AC | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | LIF1010 | |
| 无饲养层培养 | 明胶 | STEMCELL Technologies | 7903 |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| 纤连蛋白 | Millipore | FC010 | |
| Geltrex基质胶 | Gibco | A1413202 | |
| 层粘连蛋白-521 | STEMCELL Technologies | 200-0117 | |
| 细胞培养 | Accutase消化液 | Gibco | A1110501 |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04002 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 碱性磷酸酶活性检测 | BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | C3206 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胚状体形成 | 超低吸附96孔板 | Corning | 7007 |
| 核型分析 | 秋水仙素 | Beyotime | ST1173-1g |
| 畸胎瘤形成 | Y-27632 | Selleck | S1049 |
| 动物实验 | BALB/c-nu裸鼠 | Beijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| PGCLC分化 | 血清替代物 | Gibco | 10828028 |
| 骨形态发生蛋白4 | R&D Systems | 314-BP | |
| 干细胞因子 | R&D Systems | 455-MC | |
| 表皮生长因子 | R&D Systems | 236-EG | |
| 流式分选 | 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- |
| FACSAria Fusion流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| OCT4抗体 | Abcam | ab27985 | |
| SOX2抗体 | Invitrogen | 14-9811-82 | |
| NANOG抗体 | Abcam | ab80892 | |
| βIII-微管蛋白（TUJ1）抗体 | R&D Systems | MAB1195 | |
| 甲胎蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1368 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1420 | |
| PRDM1抗体 | Invitrogen | 14-5963-80 | |
| SOX17抗体 | R&D Systems | AF1924 | |
| TFAP2C抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-12762 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | 15596018 |
| RT-qPCR | Vazyme逆转录试剂盒 | Vazyme | R323-01 |
| Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-03 | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 无饲养层培养条件筛选 | ECM基质（Matrigel、Geltrex等）的品牌、浓度（低/中/高）、包被方式（培养板包被或培养基添加）、传代比、观察代数（P3） 阅读提示：Materials and methods 中 'Preliminary screening of feeder-free culture conditions for bovine embryonic stem cells' 及 Figure 1 图注 |
| 长期培养 | 培养体系（bEPSCM+Matrigel高浓度）、传代间隔（3-4天）、传代比例（1:3-1:5）、消化方法（Accutase）、细胞密度（倍增时间测定时8×10^4细胞/孔）、克隆形成实验接种量（1000细胞/孔）、冷冻保存液配方（90% FBS+10% DMSO） 阅读提示：Materials and methods 中 'Long-term culture, population doubling time, and single-cell cloning efficiency assays of feeder-free bESCs' |
| 多能性验证 | 胚状体形成细胞数（5000细胞/孔）、EB培养时间（悬浮4天+贴壁8天）、畸胎瘤形成细胞数（5×10^6细胞）、注射小鼠品系（BALB/c-nu裸鼠）、Matrigel和Y-27632浓度（30%和10μM）、核型分析使用秋水仙素浓度（0.2μg/mL）和处理时间（3小时） 阅读提示：Materials and methods 中 'Embryoid body differentiation assay'、'Teratoma formation assay'、'Karyotyping' |
| 转录组分析 | RNA-seq样本（FF-bESCs P5和P20，bEPSCs）、测序平台、比对参考基因组（ARS-UCD2.0）、差异表达阈值（|log2FC|>2且FDR<0.05） 阅读提示：Materials and methods 中 'RNA sequencing and data analysis' 及 Figure 5 图注 |
| 信号通路依赖性 | 撤除的组分（IWR1、Activin A等）、撤除代数（4代）、观察指标（菌落形态、多能性和分化标志物表达） 阅读提示：Results 中 'Wnt inhibition and Activin A are essential for maintaining pluripotency in feeder-free bESCs' 及 Figure 6 图注 |
| PGCLC分化 | 报告基因细胞系构建（TFAP2C-P2A-mCherry）、预诱导培养基成分（N2B27、5% KSR、100 ng/mL BMP4、6 μM CHIR99021、2.5 μM IWR1、10 μM Y-27632）、预诱导时间（24小时）、悬滴培养细胞数（6000细胞/孔）、分化培养基成分（GK15、200 ng/mL BMP4、100 ng/mL SCF、50 ng/mL EGF、10 ng/mL LIF、6 μM CHIR99021、2.5 μM IWR1、10 μM Y-27632）、分化时间（4天） 阅读提示：Materials and methods 中 'Induction of feeder-free bESCs differentiation into primordial germ cell-like cells' 及 Figure 7 图注 |