组织形态学引导的空间蛋白质组学分析
鉴定与斑块帽表型相关的亚区域特异性蛋白质组变化
对112例颈动脉内膜切除标本的FFPE切片进行组织学注释，通过激光显微切割分离中膜、坏死核心和纤维帽，进行LC-MS/MS分析。
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蛋白质组学揭示晚期动脉粥样硬化颈动脉斑块的空间和分子异质性
Proteomics reveals spatial and molecular heterogeneities in advanced atherosclerotic carotid artery plaques
实验完整度
高包含空间蛋白质组学分析（112例斑块）、体外VSMC模型（POVPC处理和PCSK9敲低）、独立组织样本免疫荧光验证以及血清蛋白质组学分析，具备多层级证据。
主要模型
颈动脉斑块组织（来自112例颈动脉内膜切除标本） 原代人血管平滑肌细胞（VSMCs，PeloBiotech） 独立验证队列（20例颈动脉斑块，10例薄帽和10例厚帽） 血清样本（来自505例患者）
重点核对
薄帽（TnC）与厚帽（TkC）斑块的分类标准：最小纤维帽厚度（MCT）<200 μm为薄帽，≥200 μm为厚帽。 主要分析基于112例斑块样本，每个亚区域（中膜、坏死核心、纤维帽）通过激光显微切割获取。 PCSK9与薄帽斑块相关，且在坏死核心中表达最高；在VSMC模型中，POVPC（10 μg/ml）处理72小时增加PCSK9分泌。 采用siRNA（inclisiran序列）敲低PCSK9（25 nM），处理24小时。 独立组织验证：七蛋白组合在20例斑块中通过定量免疫荧光检测，TnC斑块中阳性面积更高（P=0.003）。
摘要
动脉粥样硬化斑块破裂是脑血管事件的主要原因，然而与易损性相关的斑块形态（包括纤维帽厚度）的分子决定因素尚未完全明确。利用组织形态学引导的空间蛋白质组学，我们描绘了跨离散斑块亚区域的与斑块帽表型相关的分子程序。在112个颈动脉内膜切除标本中，薄帽斑块和厚帽斑块之间的差异主要局限于坏死核心和纤维帽。这些差异富集于与炎症、脂质处理、细胞外基质重塑和骨化/钙化相关的过程，并支持蛋白质组学斑块亚型的存在。PCSK9是与薄帽斑块相关性最强的蛋白质之一。一致地，一个坏死核心样氧化和炎症应激的体外模型增加了原发性血管平滑肌细胞中PCSK9的分泌。总之，这些发现将与帽表型相关的分子程序定位于斑块区室，并为晚期颈动脉粥样硬化中空间信息指导的生物标志物发现提供了框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 晚期颈动脉粥样硬化斑块中，与纤维帽厚度（薄帽 vs 厚帽）相关的分子程序在空间上如何分布？
- 核心机制
- 薄帽斑块与炎症、脂质处理、细胞外基质重塑和骨化/钙化相关，其中PCSK9在坏死核心中富集，可能由氧化应激和炎症诱导VSMC分泌增加。
- 主要证据
- 空间蛋白质组学分析揭示坏死核心和纤维帽中多个蛋白与薄帽状态相关；体外实验显示POVPC处理增加VSMC分泌PCSK9；独立组织验证支持蛋白组合的判别力。
- 研究意义
- 提供空间分辨的分子程序图谱，为晚期颈动脉粥样硬化的标志物发现和潜在治疗靶点（如PCSK9）提供框架，但尚需进一步验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生物信息学分析：聚类和模块分析
识别斑块亚型及其与临床特征和生物学过程的关系
对亚区域蛋白质组进行无监督聚类（递归共识聚类）和加权相关网络分析（WGCNA），并将模块与临床特征关联。
比较薄帽与厚帽斑块的蛋白差异
鉴定与薄帽表型相关的蛋白和通路
在每个亚区域中比较TnC与TkC斑块的蛋白丰度差异，并进行通路富集分析和跨亚区域相关性分析。
体外VSMC模型验证PCSK9分泌
测试氧化和炎症应激是否增加VSMC中PCSK9的分泌
用POVPC（氧化磷脂）刺激原代人VSMC，并用siRNA敲低PCSK9，测定细胞蛋白组和分泌蛋白组的变化。
蛋白组合开发和组织验证
开发并验证判别薄帽斑块的蛋白组合
基于亚区域蛋白质组数据，通过遗传算法优化七蛋白组合，并用免疫荧光在独立组织队列中验证。
血清蛋白质组学分析和面板构建
评估薄帽斑块相关信号是否在血清中可检测
对505例患者的血清进行蛋白质组学分析，并与斑块数据结合，开发血清蛋白组合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | RNAlater | Thermo Scientific | -- |
| 脱钙 | Entkalker soft SOLVAGREEN脱钙液 | Carl ROTH | -- |
| 血清采集 | S-Monovette采血管 | Starstedt | -- |
| 组织学染色 | 弹性纤维-范吉森染色 | -- | -- |
| 封片 | Pertex封片剂 | Histolab Products | -- |
| 激光显微切割 | PEN膜玻片 | MicroDissect | -- |
| Vectabond粘附剂 | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
| Leica LMD7激光显微切割显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 样品制备 | Bravo移液机器人 | Agilent | -- |
| 三乙基碳酸氢铵 | Sigma | -- | |
| 蛋白酶解 | LysC蛋白酶 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 肽段除盐 | iST 96x试剂盒 | PreOmics | -- |
| 质谱分析 | EASY-nLC 1200纳升液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| timsTOF Ultra质谱仪 | Bruker | -- | |
| ReproSil-Pur C18-AQ硅胶珠 | Dr. Maisch | -- | |
| DIA-NN | -- | -- | |
| VSMC培养 | VSMC培养基 | PeloBiotech | PB-MH-200-2100 |
| 无血清无酚红培养基 | PeloBiotech | PB-MH-200-2190-FCS-PRF | |
| 药物处理 | POVPC | -- | -- |
| siRNA敲低 | inclisiran | MedChemExpress | HY-132591 |
| 阴性对照siRNA | Ambion | AM4614 | |
| 转染 | RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778-150 |
| 细胞裂解 | BeatBox磁珠匀浆器 | PreOmics | -- |
| 蛋白组学样品处理 | iST试剂盒 | PreOmics | -- |
| Evotip Pure枪头 | Evosep | -- | |
| 血清蛋白组学 | 高氯酸 | -- | -- |
| μSPE亲水亲脂平衡板 | Waters | -- | |
| 质谱分析 | Evosep One系统 | Evosep | -- |
| Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | SuperFrost Plus载玻片 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Zeiss Axioscan 7扫描仪 | Carl Zeiss Microscopy | -- | |
| 图像分析 | QuPath | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑块样本采集和处理 | 样本类型：颈动脉内膜切除标本；固定：4%多聚甲醛24小时；脱钙：Entkalker soft SOLVAGREEN 5天；石蜡包埋。 阅读提示：Methods: Sample collection and processing for biobank - Plaque tissue |
| 组织学分析和MCT分类 | MCT分类阈值：<200 μm为薄帽，≥200 μm为厚帽；组织学染色方法：H&E和Elastica van Gieson。 阅读提示：Methods: Histomorphology-guided spatial proteomics of plaque tissues - Histological analysis |
| 激光显微切割 | 切片厚度：5 μm（用于切割）和7 μm；切割参数：激光功率57，孔径1-2，速度23，中脉冲；每亚区域切割25个圆圈，面积14,000 μm²。 阅读提示：Methods: Laser microdissection |
| 质谱样品制备和数据采集 | 消化：LysC 40 ng 4小时，胰蛋白酶60 ng过夜；色谱梯度：120分钟，3%-30% B；质谱仪：timsTOF Ultra，dia-PASEF模式，m/z 350-1200，离子淌度0.7-1.3。 阅读提示：Methods: Sample preparation for mass spectrometry and LC-MS/MS data acquisition |
| VSMC处理和PCSK9敲低 | 细胞密度：15,000细胞/孔（六孔板）；POVPC浓度：10 μg/ml，处理72小时；siRNA浓度：25 nM，处理24小时（inclisiran或负对照）。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment; Supplementary Figure 6 |