收集不同生理状态的绵羊子宫内膜组织
获取发情周期和妊娠早期的子宫内膜样本，比较ISGylation差异。
对母羊进行同期发情处理，收集EC10、EC17和P17母羊的子宫内膜组织，并通过孕酮检测确认生理状态。
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妊娠诱导的绵羊蛋白ISGylation鉴定及其功能推断I：子宫内膜
Identification of ovine proteins targeted by pregnancy-induced ISGylation and inference on function I: endometrium†
实验完整度
高包含体内母羊模型（EC10、EC17、P17）与体外BEND细胞模型，运用免疫沉淀、LC-MS/MS、Western blot、相互IP及通路分析，实现从蛋白鉴定到功能验证的多层级验证。
主要模型
妊娠第17天绵羊子宫内膜组织 发情周期第10天和第17天绵羊子宫内膜组织 牛子宫内膜细胞系BEND
重点核对
绵羊分组：EC10、EC17、P17，每组n=4 BEND细胞处理：10 ng/ml rbIFNT处理24小时 免疫沉淀使用抗rbISG15抗体，LC-MS/MS鉴定ISG化蛋白 相互免疫沉淀抗体：STAT1、MX1、ENO1 统计分析：ANOVA，Benjamini-Hochberg校正P≤0.05，FDR≤1%
摘要
反刍动物妊娠的建立依赖于胚胎滋养层分泌的干扰素-τ，它刺激母体组织中干扰素刺激基因15的产生。干扰素刺激基因15以类似泛素的方式共价结合（ISGylation）并调节细胞内蛋白质过程。本研究旨在鉴定ISG化蛋白并推断其在子宫内膜中的特定功能和生化途径。从妊娠第17天（P17，n=4）的怀孕母羊、发情周期第10天（EC10，n=4）和第17天（EC17，n=4）的同步未受精母羊（第0天为发情日）收集子宫内膜。此外，用10 ng/ml的重组牛干扰素-τ培养牛子宫内膜细胞24小时。用抗牛干扰素刺激基因15抗体免疫沉淀蛋白提取物中的ISG化蛋白。通过液相色谱-串联质谱法鉴定洗脱液中的ISG化蛋白，并通过选定ISG化蛋白的相互免疫沉淀进行确认。在EC10、EC17和P17母羊的子宫内膜中，有75种ISG化蛋白差异表达。Ingenuity通路分析表明，干扰素α/β信号、ISG15抗病毒机制、糖酵解I和糖异生I是妊娠子宫内膜中诱导的最显著通路。通过特异性抗体免疫沉淀富集了STAT1、MX1和烯醇化酶1等ISG化蛋白，并确认了它们与干扰素刺激基因15的结合。妊娠绵羊子宫内膜中鉴定出的ISG化蛋白可能在干扰素信号传导、抗病毒机制和葡萄糖代谢中发挥作用，这些通路可能对子宫内膜成功着床和维持妊娠的准备具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 绵羊子宫内膜中哪些蛋白在妊娠早期被ISG化，以及这些蛋白在干扰素信号、抗病毒和代谢通路中可能发挥什么作用？
- 核心机制
- IFNT通过诱导ISG15表达，促进STAT1、MX1和ENO1等蛋白的ISG化，从而增强干扰素信号传导、抗病毒防御和糖代谢，为胚胎着床和妊娠维持提供支持。
- 主要证据
- 免疫沉淀结合LC-MS/MS鉴定出75种妊娠诱导的ISG化蛋白；IPA分析显示干扰素信号、ISG15抗病毒、糖酵解和糖异生通路富集；相互免疫沉淀和Western blot证实STAT1、MX1和ENO1的ISG化。
- 研究意义
- 首次在体内证实IFNT驱动的蛋白ISG化在母体妊娠识别中的双重作用：增强干扰素介导的信号传导和稳定代谢酶以满足胚胎能量需求，为改善家畜繁殖效率提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫沉淀富集ISG化蛋白
从子宫内膜蛋白提取物中富集ISG15共价结合的蛋白。
使用抗rbISG15抗体对蛋白提取物进行免疫沉淀，洗脱后通过SDS-PAGE分离，切取50 kDa以上的凝胶片段用于质谱分析。
LC-MS/MS鉴定ISG化蛋白
鉴定与ISG15共价结合的蛋白并分析其差异表达。
对凝胶片段进行胶内酶解，肽段经LC-MS/MS分析，使用Proteome Discoverer 3.0处理数据，并通过Sequest HT和INFERYS进行搜索。
通路富集分析
推断ISG化蛋白参与的生物学通路。
将差异表达蛋白上传至IPA，进行经典通路分析，鉴定显著富集的通路。
体外BEND细胞验证IFNT诱导的ISG化
验证IFNT单独处理能否诱导ISG化蛋白的表达。
培养BEND细胞，用rbIFNT处理24小时，收集细胞裂解液进行免疫沉淀和Western blot分析。
相互免疫沉淀验证关键蛋白的ISG化
确认STAT1、MX1和ENO1在体内和体外被ISG化。
使用特异性抗体对BEND细胞和子宫内膜组织提取物进行免疫沉淀，然后通过Western blot和LC-MS/MS检测ISG15共价结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基（D-缬氨酸修饰） | Sigma-Aldrich Inc. | -- |
| Ham's F12培养基 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| 马血清 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| D-缬氨酸 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Sigma-Aldrich Inc. | -- | |
| 免疫沉淀 | Pierce经典免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SDS-PAGE | TGX SDS-PAGE快速制胶试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | Clarity Western ECL底物试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Amersham | -- | |
| 抗体 | 兔抗重组牛ISG15多克隆抗体 | -- | -- |
| 抗STAT1抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗烯醇化酶1抗体 | CUSABIO | -- | |
| 抗兔HRP抗体 | Millipore Sigma Merck KGaA | -- | |
| 抗小鼠HRP抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | -- | |
| 动物处理 | 前列腺素F2α | Lutalyse | -- |
| LC-MS/MS | LC-MS级水 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱级胰蛋白酶/LysC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Protease MAX表面活性剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 碳酸氢铵 | -- | -- | |
| 带集成硅发射器的C18分析柱 | Ionopticks | -- | |
| 在线富集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vanquish Neo液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | SYPRO Ruby蛋白凝胶染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白消化 | 二硫苏糖醇 | -- | -- |
| 蛋白定量 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组与取材 | 对照组（EC10和EC17）需同步发情处理，妊娠组（P17）需自然交配；每组动物数量（n=4）；子宫内膜取材部位（妊娠组取孕角，发情周期组取黄体同侧）。 阅读提示：Materials and Methods: Animals and experimental design |
| 免疫沉淀 | 蛋白上样量（500 μg）；抗rbISG15抗体用量（10 μg）；孵育时间和温度；洗涤和洗脱条件。 阅读提示：Materials and Methods: Protein extraction and enrichment of ISGylated proteins by immunoprecipitation |
| LC-MS/MS分析 | 酶切条件（Trypsin/LysC用量、Protease MAX浓度）；色谱梯度（30 min，1-6%B到45%B）；质谱参数（动态排除时间、碰撞能量）。 阅读提示：Materials and Methods: Sample preparation (in-gel trypsin digestion) and Identification of proteins by mass spectrometry analysis |
| BEND细胞处理 | 细胞来源（ATCC CRL-2398）；代次（早期传代<32）；处理浓度（10 ng/ml rbIFNT）和时间（24小时）。 阅读提示：Materials and Methods: Bovine endometrial cell culture |
| 相互免疫沉淀 | 抗体特异性（STAT1、MX1、ENO1）；抗体用量和蛋白量；Western blot检测条件。 阅读提示：Materials and Methods: Reciprocal immunoprecipitation of selected target proteins with specific antibodies |