验证ALDH1A1表达上调
检测ALDH1A1在ADPKD中的表达变化。
通过Western blot和qRT-PCR检测Pkd1突变细胞和小鼠肾脏及人ADPKD肾脏中ALDH1A1的表达，并利用免疫组化观察其定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
乙醛脱氢酶1A1调控PD-L1的转录，其与双硫仑靶向治疗联合PD-L1免疫治疗协同延缓ADPKD囊肿生长
Aldehyde dehydrogenase 1 A1 regulates the transcription of PD-L1 and its targeting with disulfiram together with PD-L1 immunotherapy synergistically delays cyst growth in ADPKD
实验完整度
高包含细胞系、两种Pkd1突变小鼠模型、基因敲除和药物抑制实验，并进行了Western blot、qRT-PCR、免疫组化、流式、ChIP和CUT&Tag等多层级验证，以及功能验证和机制验证。
主要模型
Pkd1 nl/nl 小鼠模型（快速进展型） Pkd1 RC/RC 小鼠模型（缓慢进展型） Pkd1 条件敲除小鼠模型（Pkd1flox/flox:Aldh1A1−/−:Ksp-Cre） Pkd1 突变肾上皮细胞系（PN24细胞）
重点核对
模型：Pkd1nl/nl、Pkd1RC/RC、Pkd1flox/flox:Aldh1A1−/−:Ksp-Cre小鼠 ALDH1A1抑制剂量：DSF 50 mg/kg，腹腔注射，每两天一次 PD-L1抗体剂量：10F.9G2 10 mg/kg，每周三次 处理时间：Pkd1nl/nl小鼠从PN8至PN27，Pkd1RC/RC小鼠从1月龄至90天 关键对照：DMSO或PBS对照，以及Pkd1flox/flox:Aldh1A1+/+:Ksp-Cre和野生型小鼠
摘要
引言：ADPKD是最常见的遗传性肾脏疾病，目前没有有效疗法可阻止其进展。ALDH1A1是乙醛脱氢酶家族的一员，是已知氧化9-顺式视黄醛为9-顺式维甲酸的主要ALDH1同工酶，后者可调控PKD1基因的表达。然而，ALDH1A1在ADPKD中的作用和机制仍不明确。方法：为了研究ALDH1A1在ADPKD中的作用，我们在Pkd1突变小鼠模型中敲除Aldh1A1，并单独或联合PD-L1抗体使用双硫仑（DSF）抑制ALDH1A1。通过免疫染色、Western blot、qRT-PCR和流式细胞术分析以及CUT&Tag分析和CHIP实验，检测了ALDH1A1对囊肿生长、免疫应答和PKD相关信号通路以及ALDH1A1靶基因的影响。结果：ALDH1A1在ADPKD肾脏中上调，导致PKD相关信号通路（包括AKT、S6、STAT3和Rb）的激活，这可能由AURKA介导，从而增加囊性肾上皮细胞的增殖。敲除Aldh1A1可延缓Pkd1突变肾脏的囊肿生长。ALDH1A1作为一种转录因子靶向多种基因（通过CUT-Tag分析检测），升高的ALDH1A1调控Pd-l1和Ccl2的转录，分别影响PD-L1介导的免疫监视和巨噬细胞的募集。用DSF抑制ALDH1A1在侵袭性和温和Pkd1小鼠模型中减少了囊肿生长。此外，靶向ALDH1A1联合PD-L1抗体在Pkd1突变小鼠肾脏中延缓囊肿生长具有协同作用。结论：本研究提示双硫仑是ADPKD治疗的有前景的药物，并强调了化疗与免疫治疗联合治疗ADPKD的新型治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ALDH1A1在ADPKD中的作用及其机制，以及靶向ALDH1A1联合PD-L1免疫治疗能否有效延缓囊肿生长。
- 核心机制
- ALDH1A1作为转录因子直接结合并调控Pd-l1和Ccl2的转录，同时通过激活PKD相关信号通路（AKT、S6、STAT3、Rb等，可能经AURKA介导）促进细胞增殖，并通过NF-κB信号抑制细胞凋亡。
- 主要证据
- 在Pkd1突变细胞系和小鼠模型中，敲除或抑制ALDH1A1导致PKD相关信号通路激活减弱、细胞增殖降低、凋亡增加，且CUT&Tag和ChIP实验显示ALDH1A1富集于靶基因启动子。
- 研究意义
- 研究表明双硫仑是ADPKD治疗的有前景的药物，并提出了化疗联合免疫治疗（双硫仑+抗PD-L1）作为ADPKD的新型治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因敲除验证功能
确定ALDH1A1对囊肿生长的因果作用。
生成Pkd1flox/flox:Aldh1A1−/−:Ksp-Cre小鼠，比较其与对照小鼠的囊肿指数、KW/BW、BUN、细胞增殖和凋亡。
药物抑制ALDH1A1
评估DSF对囊肿生长的治疗效果。
分别用DSF或溶剂处理Pkd1nl/nl和Pkd1RC/RC小鼠，检测囊肿指数、KW/BW、BUN、增殖和凋亡。
免疫微环境分析
探究ALDH1A1抑制对免疫细胞浸润和分化的影响。
通过F4/80染色和流式细胞术检测巨噬细胞和T细胞亚群比例。
机制研究：信号通路和转录调控
解析ALDH1A1调控细胞增殖、凋亡和免疫应答的分子机制。
通过Western blot检测信号通路蛋白磷酸化变化；通过ChIP和CUT&Tag验证ALDH1A1作为转录因子直接结合靶基因。
联合治疗评估
验证ALDH1A1抑制联合PD-L1抗体是否具有协同效应。
用DSF、抗PD-L1抗体、两者联合或溶剂处理Pkd1小鼠，比较囊肿指数、KW/BW、BUN、增殖和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 双硫仑 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | BAY-11-7085 | -- | -- |
| 免疫治疗 | PD-L1抗体10F.9G2 | -- | -- |
| 细胞因子处理 | 肿瘤坏死因子α | -- | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型及处理 | 小鼠品系（Pkd1nl/nl、Pkd1RC/RC）、遗传背景（129S/6）、DSF剂量（50 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每两天一次）、处理时间（Pkd1nl/nl从PN8至PN27；Pkd1RC/RC从1月龄至3月龄）、抗PD-L1剂量（10 mg/kg）、频率（每周三次） 阅读提示：Methods: Mouse strains and treatments |
| 基因敲除模型 | 敲除策略（Pkd1flox/flox:Aldh1A1−/−:Ksp-Cre）、对照（Pkd1flox/flox:Aldh1A1+/+:Ksp-Cre）、分析时间（PN10）、动物来源（Aldh1A1−/−小鼠由Vasilis Vasiliou提供） 阅读提示：Methods: Mouse strains and treatments; Figure 2 legends |
| 细胞增殖与凋亡检测 | Ki67染色定量方法（统计每1000个核中的阳性核数）、TUNEL实验条件、样本量（n=3） 阅读提示：Figure 3e and f legends; Methods |
| 免疫分析 | 流式细胞术的细胞制备、抗体组合（F4/80、CD11b、CD4、CD8、CD69、CD62L）、门控策略、样本量 阅读提示：Figure 4, 8 and Supplementary Figure S12 legends |
| 分子机制分析 | ChIP实验条件（抗体、IgG对照）、CUT&Tag条件（抗体、数据分析参数）、Western blot抗体及浓度 阅读提示：Figure 5f, 6 legends; Supplementary Methods |