建立Ddr1敲除的肿瘤细胞系
研究DDR1在肿瘤生长和免疫中的作用。
在E0771、M-Wnt和AT-3细胞系中使用CRISPR-Cas9敲除Ddr1，并验证DDR1蛋白缺失。
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肿瘤DDR1促进胶原纤维排列以引发免疫排斥
Tumour DDR1 promotes collagen fibre alignment to instigate immune exclusion
实验完整度
高包含Ddr1敲除细胞系、小鼠移植瘤模型、自发肿瘤模型、患者样本及RNA-seq等多层级证据，并进行功能验证与机制研究。
主要模型
E0771小鼠三阴性乳腺癌细胞系 M-Wnt小鼠乳腺癌细胞系 AT-3小鼠乳腺癌细胞系 MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠模型
重点核对
Ddr1敲除的验证（CRISPR-Cas9，测序确认） 免疫缺陷与免疫健全小鼠中的肿瘤生长差异 CD8+ T细胞耗竭或过继转移对肿瘤生长的影响 DDR1-ECD与胶原结合能力（ELISA） 胶原纤维排列与长度（SHG显微镜，CT-Fire软件量化）
摘要
免疫排斥预示着包括三阴性乳腺癌（TNBC）在内的多种恶性肿瘤患者预后不良。细胞外基质（ECM）导致免疫排斥。然而，减少ECM丰度的策略大多无效或产生不良后果。在这里，我们显示盘状结构域受体1（DDR1），一种具有酪氨酸激酶活性的胶原受体，通过促进胶原纤维排列引发免疫排斥。在TNBC小鼠模型中，肿瘤中Ddr1的敲除促进了T细胞的瘤内浸润并消除了肿瘤生长。支持这一发现的是，在人类TNBC中，DDR1的表达与抗肿瘤T细胞的瘤内丰度呈负相关。DDR1胞外域（DDR1-ECD），而非其胞内激酶域，是免疫排斥所必需的。非膜锚定的DDR1-ECD足以在免疫功能正常宿主中挽救Ddr1敲除肿瘤的生长。机制上，DDR1-ECD与胶原的结合强制胶原纤维排列并阻碍免疫浸润。ECD中和抗体破坏胶原纤维排列，减轻免疫排斥，并在免疫功能正常宿主中抑制肿瘤生长。总之，我们的发现确定了免疫排斥的一种机制，并提出了一个通过重塑肿瘤ECM来增加免疫可及性的免疫治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DDR1如何通过细胞外机制促进免疫排斥并影响肿瘤生长？
- 核心机制
- DDR1-ECD与胶原结合，促进胶原纤维排列，形成物理屏障阻碍T细胞浸润，从而介导免疫排斥。
- 主要证据
- 在多种TNBC小鼠模型中，Ddr1敲除肿瘤在免疫健全宿主中生长受抑，CD8+ T细胞浸润增加，且DDR1-ECD结合胶原突变体无法挽救肿瘤生长；人类TNBC样本中DDR1表达与CD8+ T细胞浸润负相关。
- 研究意义
- 揭示了DDR1-ECD作为免疫治疗靶点的潜力，通过靶向ECM重塑增强免疫可及性，为癌症免疫治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内肿瘤生长实验
评估Ddr1敲除对免疫功能正常和免疫缺陷小鼠中肿瘤生长的影响。
将Ddr1-WT和Ddr1-KO肿瘤细胞接种到C57BL/6、Rag1−/−和裸鼠中，监测肿瘤体积。
免疫细胞分析
分析Ddr1敲除对肿瘤浸润T细胞数量和功能的影响。
通过流式细胞术检测肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞数量、IFNγ产生、激活标志物等；通过免疫组化检测CD8+ T细胞在肿瘤边缘和核心的分布。
人乳腺癌样本分析
验证DDR1表达与免疫浸润的临床相关性。
分析TCGA及CPTAC数据中DDR1表达与免疫标志物的相关性；对TNBC患者样本进行多重免疫荧光染色，评估DDR1高/低表达组中CD8+ T细胞分布。
DDR1-ECD功能及胶原结合研究
确定DDR1-ECD在免疫排斥中的关键作用及其胶原结合依赖性。
在Ddr1-KO细胞中表达DDR1-ECD、ΔKD和胶原结合突变体，评估其对肿瘤生长的影响；用ELISA检测突变体与胶原的结合能力。
细胞外基质重塑分析
研究DDR1对胶原纤维排列和T细胞迁移的影响。
通过SHG显微镜观察肿瘤胶原纤维排列和长度，用CT-Fire量化；用脱细胞ECM进行T细胞迁移实验。
抗DDR1中和抗体的开发与验证
评估靶向DDR1-ECD的抗体能否破坏胶原屏障、恢复免疫浸润并抑制肿瘤生长。
通过免疫兔子生成抗人DDR1单克隆抗体，筛选中和抗体；在移植瘤和自发肿瘤模型中测试抗体的抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑
蛋白表达检测
细胞增殖检测
胶原分析
细胞迁移分析
分子结合分析
转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 基因编辑 | DDR1 sgRNA CRISPR/Cas9慢病毒载体套装 | abm | 177841140595 |
| 非靶向sgRNA的CRISPR-Cas9载体 | abm | K010 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | 11668027 |
| 蛋白印迹 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 |
| 抗DDR1抗体 | CST | 5583S | |
| 抗DDR2抗体 | Sigma | MABT322 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 2118S | |
| 抗β-actin抗体 | Bio-Rad | 12004163 | |
| 抗Flag抗体 | Millipore Sigma | F3165-5MG | |
| 兔抗山羊HRP标记IgG | R&D Systems | HAF017 | |
| 山羊抗小鼠HRP标记IgG | Invitrogen | 31430 | |
| 山羊抗兔HRP标记IgG | Invitrogen | 31460 | |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | 75870-454 |
| 细胞活性检测 | MTT | -- | -- |
| 细胞迁移 | EasySep小鼠CD8+阴性分选试剂盒 | STEMCELL | 19853 |
| 重组CCL21 | R&D Systems | 4576C025CF | |
| 免疫组化 | 抗原修复液 | Vector Labs | H-3300 |
| To-pro-3核染料 | Fisher | T3605 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| 10%缓冲福尔马林 | Thermo Fisher Scientific | 23-427098 | |
| 抗CD8α抗体 | CST | 98941 | |
| 抗CD3e抗体 | Invitrogen | MA5-14524 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| ABC过氧化物酶检测系统 | Vector Labs | PK-6105 | |
| DAB显色液 | Vector Labs | SK-4105 | |
| 流式细胞术 | Ghost活力染料紫510 | Tonbo Biosciences | 13-0870 |
| 抗CD16/32抗体 | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| 抗CD45-BV 645抗体 | Invitrogen | 64-0451-82 | |
| 抗CD3-efluor 660抗体 | eBiosciences | 50-0032-82 | |
| 抗CD4-FITC抗体 | eBiosciences | 35-0042-U500 | |
| 抗CD8-APC-Cy7抗体 | BD | 557654 | |
| 抗CD44-BV 786抗体 | Biolegend | 103059 | |
| 抗CD62L-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 104424 | |
| 抗IFN-γ-PE/Cy7抗体 | Biolegend | 505826 | |
| 抗Gzmb-PE抗体 | Invitrogen | 12-8898-82 | |
| 抗Ki67-PE抗体 | Biolegend | 652404 | |
| Foxp3/转录因子染色试剂盒 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| T-Activator CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher Scientific | 11453D | |
| 白细胞激活混合物与BD GolgiPlug | BD Biosciences | 550583 | |
| BD Cytofix/Cytoper试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| BD FACSCelesta流式细胞仪 | BD | -- | |
| ELISA | 洗涤缓冲液 | R&D Systems | WA126 |
| 试剂稀释液 | R&D Systems | DY995 | |
| 重组人DDR1-ECD蛋白 | Sino Biological | 10730-H08H | |
| 抗DDR1 N端抗体 | R&D Systems | AF2396 | |
| 链霉亲和素-HRP | R&D Systems | 893975 | |
| 底物溶液 | R&D Systems | DY999 | |
| 终止液 | R&D Systems | DY994 | |
| TMB底物 | Sigma | -- | |
| 96孔板读板机 | Molecular Devices | -- | |
| 抗体生成 | 重组人DDR1-ECD蛋白 | Sino Biological | 10730-H08H |
| 抗体验证 | 抗兔F(ab)2 HRP标记IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- |
| 蛋白表达 | 蛋白A亲和树脂 | -- | -- |
| SHG成像 | Leica TCS SP8多光子共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 20x HC PL Apo NA 0.7油浸物镜 | Leica | -- | |
| 多重免疫荧光 | Vectra 3.0自动化定量病理成像系统 | PerkinElmer/Akoya | -- |
| Phenochart软件 | PerkinElmer/Akoya | -- | |
| inForm高级图像分析软件 | PerkinElmer/Akoya | inForm | |
| PhenoptrReports软件 | Akoya | -- | |
| 成像 | Nikon ECLIPSE Ti2显微镜 | Nikon | -- |
| 多重免疫荧光 | 抗原修复液6 | Akoya | AR6001KT |
| 抗原修复液9 | Akoya | AR9001KT | |
| 抗体稀释液/封闭液 | Akoya | ARD1001EA | |
| 光谱DAPI | Akoya | FP1490 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
| StatLab #1盖玻片 | StatLab | CV102450 | |
| DDR1抗体（AF2396，R&D） | R&D Systems | AF2396 | |
| CD8抗体（M7103） | Agilent | M7103 | |
| panCK抗体（M3515） | Agilent | M3515 | |
| 实验动物 | C57BL/6小鼠 | Jackson Laboratory | 000664 |
| Rag1−/−小鼠 | Jackson Laboratory | 002216 | |
| 裸鼠 | Jackson Laboratory | 002019 | |
| MMTV-PyMT FVB小鼠 | Jackson Laboratory | 002374 | |
| MMTV-PyMT C57BL/6小鼠 | Jackson Laboratory | 022974 | |
| 抗体验证 | 抗小鼠CD8抗体（克隆2.43） | BioxCell | BE0061 |
| IgG2b同型对照（克隆LTF-2） | BioxCell | BE0090 | |
| 测序 | Illumina TruSeq链式mRNA-seq样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 3000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Ddr1敲除 | CRISPR-Cas9敲除效率、sgRNA序列、验证方法 阅读提示：Methods：CRISPR knockout and construction of DDR1 expression plasmids |
| 肿瘤生长实验 | 小鼠品系、细胞注射量、肿瘤细胞系、测量时间点 阅读提示：Methods：Treatments and tumour studies in mice |
| 免疫细胞浸润分析 | 肿瘤重量归一化、抗体克隆、染色方案 阅读提示：Methods：Flow cytometry、Immunohistochemistry |
| 胶原纤维分析 | SHG成像参数、组织处理、纤维排列和长度量化软件 阅读提示：Methods：Second harmonic generation |
| 抗体治疗 | 抗体克隆、给药剂量、给药途径、治疗时间 阅读提示：Methods：Treatments and tumour studies in mice、Screening and generation of anti-DDR1 monoclonal antibodies |