招募队列和样本采集
建立疫苗接种者队列,评估体液免疫反应随时间的变化。
招募32名无SARS-CoV-2感染史的志愿者,接受Moderna或Pfizer-BioNTech mRNA疫苗,在初次接种后、加强后1.3个月和5个月采集血液样本。
Anti-SARS-CoV-2 receptor-binding domain antibody evolution after mRNA vaccination
包含多层级实验:血浆ELISA和中和试验、流式细胞术分析记忆B细胞、单细胞抗体测序、单克隆抗体中和试验、生物层干涉亲和力测定和表位作图,以及变异株交叉中和试验。
SARS-CoV-2未感染个体队列 293T/ACE2细胞 HT1080/ACE2.cl14细胞
血浆样本采集时间点:初次接种后平均2.5周,加强后平均1.3个月和5个月。 疫苗接种类型:Moderna (mRNA-1273) 或 Pfizer-BioNTech (BNT162b2)。 中和试验细胞:293T/ACE2细胞用于野生型,HT1080/ACE2.cl14细胞用于突变和变异株。 抗体中和活性判定:IC50 > 1000 ng/ml 为非中和抗体。 假病毒变异株:B.1.1.7, B.1.351, B.1.526, P.1, B.1.617.2。
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立疫苗接种者队列,评估体液免疫反应随时间的变化。
招募32名无SARS-CoV-2感染史的志愿者,接受Moderna或Pfizer-BioNTech mRNA疫苗,在初次接种后、加强后1.3个月和5个月采集血液样本。
评估疫苗接种后血浆中抗RBD抗体的结合水平和中和活性。
通过ELISA检测血浆IgM、IgG和IgA抗体对RBD的结合,并使用HIV-1假病毒中和试验测定中和滴度(NT50)。
评估疫苗接种后RBD特异性记忆B细胞的数量和表型变化。
使用流式细胞术对WT和变异株RBD结合的记忆B细胞进行计数,并分析其表型(IgG、IgM、IgA表达)。
分析疫苗接种后记忆B细胞库的克隆演变和体细胞高频突变。
对抗原特异性记忆B细胞进行单细胞分选,通过RT-PCR扩增抗体重链和轻链基因,测序分析抗体序列,并分配克隆型。
评估记忆B细胞来源的单克隆抗体的中和活性和广度。
使用假病毒中和试验测定单克隆抗体的IC50,并比较初次接种后、加强后1.3个月和5个月获得的抗体的中和活性。
评估疫苗接种后抗体亲和力成熟和表位靶向变化。
使用生物层干涉技术(BLI)测量抗体的解离常数(Kd),并通过竞争实验确定抗体靶向的RBD表位类别。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | Corning 3690 96半孔板 | Corning | 3690 |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗人IgG、IgM、IgA二抗 | Jackson Immuno Research | 109-036-088 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗人IgA二抗 | Sigma | A0295 | |
| 酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 假病毒包装 | 293T细胞 | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080细胞 | ATCC | CCL-121 | |
| 中和试验 | 荧光素酶细胞裂解液5× | Promega | -- |
| Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| Glomax Navigator | Promega | -- | |
| 流式细胞术 | 生物素-蛋白连接酶-BIRA试剂盒 | Avidity | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉亲和素-BV711 | BD Biosciences | 563262 | |
| 链霉亲和素-PE | BD Biosciences | 554061 | |
| 链霉亲和素-AF647 | BioLegend | 405237 | |
| 全B细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-638 | |
| 抗CD20-PECy7抗体 | BD Biosciences | 335793 | |
| 抗CD3-APC-eFluor 780抗体 | Invitrogen | 47-0037-41 | |
| 抗CD8-APC-eFluor 780抗体 | Invitrogen | 47-0086-42 | |
| 抗CD16-APC-eFluor 780抗体 | Invitrogen | 47-0168-41 | |
| Zombie NIR活力染料 | BioLegend | 423105 | |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2615 | |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 抗CD19-BV605抗体 | BioLegend | 302244 | |
| 抗IgD-BV421抗体 | BioLegend | 348226 | |
| 抗CD27-FITC抗体 | BD Biosciences | 555440 | |
| 抗CD71-PerCP-Cy5.5抗体 | BioLegend | 334114 | |
| 抗IgG-PECF594抗体 | BD Biosciences | 562538 | |
| 抗IgM-AF700抗体 | BioLegend | 314538 | |
| 抗IgA-Viogreen抗体 | Miltenyi Biotec | 130-113-481 | |
| 抗体测序 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080-044 |
| 亲和力测定 | Octet Red生物层干涉仪 | ForteBio | -- |
| 蛋白A生物传感器 | ForteBio | 18-5010 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆ELISA | 血浆起始稀释度:1:66;二抗稀释度:IgM/IgG为1:5000,IgA为1:3000;TMB孵育时间:血浆10分钟,单克隆抗体4分钟;阳性对照:COV72血浆。 阅读提示:Methods: ELISAs |
| 中和试验 | 假病毒类型:pNL4-3ΔEnv-nanoluc和pSARS-CoV-2-SΔ19;细胞:293T/ACE2(WT)和HT1080/ACE2.cl14(突变/变异株);感染时间:48小时;检测:Nano-Glo荧光素酶。 阅读提示:Methods: SARS-CoV-2-pseudotyped reporter virus, Pseudotyped virus neutralization assays |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号:anti-CD20-PECy7 (BD 335793), anti-CD3-APC-eFluor 780 (Invitrogen 47-0037-41)等;RBD标记:WT RBD-PE和K417N/E484K/N501Y RBD-AF647;分选策略:CD3-CD8-CD14-CD16-CD20+Ova-RBD+。 阅读提示:Methods: Flow cytometry and single-cell sorting |
| 单克隆抗体中和试验 | 抗体浓度范围:起始10 μg/ml,四倍稀释;假病毒突变株列表(见补充表);细胞:293T/ACE2或HT1080/ACE2.cl14。 阅读提示:Methods: Pseudotyped virus neutralization assays; 图3图注 |
| 亲和力测定 | BLI仪器:Octet Red (ForteBio);传感器:蛋白A (ForteBio 18-5010);RBD浓度:20, 10, 5 μg/ml;结合时间:300秒;解离时间:600秒;拟合模型:1:1。 阅读提示:Methods: Biolayer interferometry |