开发DNA seqFISH+技术
建立能够在单细胞中成像数千个染色体位点的方法。
基于seqFISH和Oligopaint技术，编码3,660个位点，包括1 Mb分辨率的全基因组位点和25 kb分辨率的20个区域，并通过80轮连续杂交进行成像。
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整合空间基因组学揭示单细胞核的整体结构
Integrated spatial genomics reveals global architecture of single nuclei
实验完整度
高文献包含DNA seqFISH+、RNA seqFISH、连续IF等多模态成像，并通过模型细胞、克隆分析及多种验证（如与Hi-C、ChIP-seq比较）提供功能与机制验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESCs） GFP/Neo E14单克隆细胞系 未标记E14细胞克隆群体
重点核对
DNA seqFISH+靶向位点数量：3,660个（1 Mb分辨率2,460个，25 kb分辨率1,200个） 细胞数量：446个单细胞，来自两个生物学重复 IF标记数量：17种抗体（如H3K27me3、H3K9ac、SF3a66等） 克隆追踪实验的时间点：24小时和48小时（约2和4代） 统计方法：Spearman相关、Wilcoxon符号秩检验、bootstrap重采样
摘要
识别染色体结构、核体、染色质状态和基因表达之间的关系是核组织研究的总体目标。由于单细胞在这些水平上似乎都具有高度可变性，因此有必要在同一细胞中绘制不同的模态。在这里，我们通过DNA seqFISH+对单个小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的3,660个染色体位点进行成像，同时通过连续免疫荧光（IF）对17种染色质标记和亚核结构进行成像，并利用70种RNA的表达谱进行分析。我们发现许多位点在单个mESC中与IF标记不变地关联。这些位点形成单细胞核组织中的“固定点”，通常出现在核体表面和由组合染色质标记定义的区域。此外，高表达的基因似乎被预先定位到活跃的核区域，与单细胞中的爆发动力学无关。我们的分析还揭示了几个具有特征性组合染色质状态的独特mESC亚群。通过克隆分析，我们显示某些染色质标记的全局水平，如H3K27me3和macroH2A1 (mH2A1)，至少可遗传3-4代，而其他标记在更快的时间尺度上波动。这种基于seqFISH+的空间多模态方法可用于探索不同生物系统中的核组织和细胞状态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在单细胞水平同时成像染色体结构、核体、染色质状态和基因表达，并揭示它们之间的组织原则？
- 核心机制
- 许多DNA位点与特定的核体或染色质标记存在固定关联，形成核组织的“固定点”；高表达基因预先定位到活跃核区域；某些染色质标记（如H3K27me3和mH2A1）具有跨代遗传性。
- 主要证据
- 通过DNA seqFISH+和连续IF在446个单细胞中成像3,660个位点和17种标记，发现固定点；通过克隆追踪实验显示染色质状态的遗传性；与Hi-C、ChIP-seq等数据验证一致性。
- 研究意义
- 该空间多模态方法可用于探索不同生物系统中的核组织和细胞状态，为进一步研究核组织的机制和细胞状态提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
整合多模态成像
在同一细胞中同时获得染色体结构、染色质修饰和基因表达信息。
将DNA seqFISH+与RNA seqFISH和连续IF结合，对17种抗体（包括核纤层、核斑、核仁和组蛋白修饰）和70个mRNA进行成像，并确保图像精确对齐。
分析固定位点
识别单细胞中与特定IF标记稳定关联的DNA位点。
计算每个DNA位点与IF标记的物理距离，定义“固定位点”为在大多数细胞中接近特定IF标记的位点，并分析其在染色体上的分布。
定义核区室
基于组合染色质标记划分细胞核内的不同功能区域。
对IF图像中的体素进行聚类，得到12个核区室，对应已知核体（如核斑、核仁）和异染色质区域，并分析DNA位点与这些区室的关联。
检验基因预定位
探究高表达基因是否预先定位到活跃核区域。
通过分析DNA位点与活跃区室的关联以及mRNA表达和内含子活性，发现高表达基因在单细胞中与活跃区室的关联与表达水平不相关，支持预定位模型。
表征全局染色质状态异质性
揭示单细胞间全局染色质修饰水平的差异。
基于IF强度对细胞进行聚类，发现至少7种染色质状态，且与转录状态部分重叠，与细胞周期阶段大多独立。
克隆追踪实验
评估染色质状态和染色体组织的跨代遗传性。
将未标记mESCs与GFP标记细胞共培养，分析同一克隆内细胞间相关性的变化，发现某些染色质标记（如H3K27me3、mH2A1）在克隆内高度相关，而染色体邻近性在2代后消失。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 探针合成 | Twist Bioscience寡核苷酸池 | Twist Bioscience | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 体外转录试剂盒 | NEB | E2040S | |
| 逆转录酶 | Thermo Fisher | EP0751 | |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| 细胞培养 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 人层粘连蛋白 | BioLamina | -- | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| 超纯BSA | Invitrogen | AM2616 | |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma | D4911 | |
| 鲑鱼精DNA | Invitrogen | AM9680 | |
| SUPERase In RNA酶抑制剂 | Invitrogen | AM2694 | |
| BS(PEG)5交联剂 | Thermo Scientific | A35396 | |
| Tris-HCl缓冲液 | Alfa Aesar | J62848 | |
| 抗体偶联 | Zeba脱盐离心柱 | Thermo Scientific | 89882 |
| SM(PEG)2交联剂 | Thermo Scientific | 22102 | |
| Amicon超滤离心管 | Millipore | UFC505096 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| SiteClick R-PE抗体标记试剂盒 | Life Technologies | S10467 | |
| 抗体 | mH2A1抗体 | Abcam | ab232602 |
| E-钙黏蛋白抗体 | R&D | AF748 | |
| 纤维蛋白抗体 | Cell Signaling | 2639BF | |
| Geminin抗体 | Abcam | ab238988 | |
| GFP抗体 | Invitrogen | G10362 | |
| H3抗体 | Active Motif | 39763 | |
| H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 | |
| H3K27me2抗体 | Cell Signaling | 9728BF | |
| H3K27me3抗体 | Cell Signaling | 9733BF | |
| H3K4me1抗体 | Cell Signaling | 5326S | |
| H3K4me2抗体 | Cell Signaling | 9725BF | |
| H3K4me3抗体 | Active Motif | 39915 | |
| H3K9ac抗体 | Active Motif | 91103 | |
| H3K9me2抗体 | Abcam | ab1220 | |
| H3K9me3抗体 | Diagenode | MAb-146-050 | |
| H3pSer10抗体 | Millipore | 05-806 | |
| H4K16ac抗体 | EMD Millipore | 07-329 | |
| H4K20me1抗体 | Abcam | ab9051 | |
| H4K20me2抗体 | Abcam | ab9052 | |
| H4K20me3抗体 | Active Motif | 39671 | |
| 核纤层蛋白B1抗体 | Abcam | ab220797 | |
| RNA聚合酶II Ser5-P抗体 | Abcam | ab5408 | |
| SF3a66抗体 | Abcam | ab77800 | |
| 成像 | DAPI | Sigma | D8417 |
| Alexa Fluor 647-NHS酯 | Invitrogen | A20006 | |
| Cy3B-NHS酯 | GE Healthcare | PA63101 | |
| Alexa Fluor 488-NHS | Invitrogen | A20000 | |
| 读出探针 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 连接桥寡核苷酸 | IDT | -- | |
| 快速连接试剂盒 | NEB | M2200 | |
| ATP | NEB | P0756 | |
| Label IT核酸修饰试剂 | Mirus Bio | MIR | |
| 甲酰胺 | Invitrogen | AM9342 | |
| 硫酸葡聚糖 | Millipore | 3710-OP | |
| RNase A/T1混合液 | Thermo Fisher | EN0551 | |
| RNA seqFISH探针 | -- | -- | |
| 内含子FISH探针 | -- | -- | |
| 端粒探针 | -- | -- | |
| MinSat探针 | -- | -- | |
| 显微设备 | Leica DMi8显微镜 | Leica | -- |
| Yokogawa CSU-W1共聚焦扫描头 | Yokogawa | -- | |
| Andor Zyla 4.2 Plus sCMOS相机 | Andor | -- | |
| 63倍油镜 | Leica | -- | |
| 电动载物台 | ASI | MS2000 | |
| 光纤耦合激光器 | CNI | -- | |
| 注射泵 | Hamilton Company | 63133-01 | |
| 多通道流体阀 | IDEX Health & Science | EZ1213-820-4 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：E14 mESCs (E14Tg2a.4)；培养条件：血清/LIF；细胞密度和共培养比例（1:10） 阅读提示：Methods，Cell culture and preparation |
| DNA seqFISH+成像 | 靶位点数量：3,660个；分辨率：1 Mb和25 kb；杂交轮数：80轮；条形码方案：16碱基、5轮条形码；检测效率：约50% 阅读提示：Methods，DNA seqFISH+ encoding strategy, Cell culture experiment, Extended Data Fig. 1 |
| 连续免疫荧光 | 抗体列表：17种（如H3K27me3、H3K9ac等）；抗体浓度：1-5 ng/μL；固定条件：4% PFA和BS(PEG)5 阅读提示：Methods，Cell culture experiment, Antibody list |
| 图像分析 | 图像对齐方法：fiducial markers, 相位相关；点检测阈值和错误率；距离计算：300 nm 阈值；区域聚类：12个区室 阅读提示：Methods，Image Analysis, IF normalization and clustering analysis |
| 克隆追踪实验 | 共培养比例：1:10（未标记：GFP标记）；时间点：24和48小时；分析指标：细胞对相关性（RNA、IF、染色体邻近性） 阅读提示：Methods，Colony analysis, Fig. 4 |