天然甘氨酸受体的提取与纯化
获得内源性甘氨酸受体用于结构研究
猪脊髓和脑干组织经匀浆、离心提取膜蛋白，使用1% DDM和0.1% CHS进行增溶，通过2-氨基士的宁亲和层析纯化受体，并对纯化产物进行质谱和Western blot验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
天然甘氨酸受体的结构及组装机制
Architecture and assembly mechanism of native glycine receptors
实验完整度
高研究包含冷冻电镜结构解析、配体结合实验、Western blot、质谱、FSEC热稳定性分析及重组表达验证等多个独立证据层级，明确包含结构和功能验证。
主要模型
猪脊髓和脑干组织提取的天然甘氨酸受体 HEK 293 (TSA201)细胞重组表达的猪α1/β甘氨酸受体 Sf9昆虫细胞表达的3D1 Fab
重点核对
甘氨酸受体来源：猪脊髓和脑干（约50-56g） 蛋白纯化：2-氨基士的宁亲和层析柱 冷冻电镜样品制备：0.05 mg/mL蛋白浓度，添加20 mM甘氨酸，Quantifoil 200目金网，2 nm连续碳膜 数据采集：Titan Krios，K3探测器，像素大小0.823 Å 主要化学计量比：异聚体甘氨酸受体为4α:1β
摘要
甘氨酸受体（GlyRs）是五聚体‘Cys-loop’受体，可形成氯离子通透性通道，并在中枢神经系统中介导快速抑制性信号传导。在脊髓和脑干中，GlyRs调节运动，当发生突变时会导致运动障碍。然而，天然GlyRs的化学计量比及其组装机制目前仍不清楚，尽管已有大量研究。本文报告了猪脊髓和脑干中天然GlyRs的近原子分辨率结构，首次揭示异聚体受体的结构信息及其主要的4个α亚基：1个β亚基的化学计量比。在异聚体五聚体中，β亚基(+)/α亚基(−)界面采用了不同于α亚基(+)/α亚基(−)和α亚基(+)/β亚基(−)界面的独特结构。此外，β亚基含有一个独特的苯丙氨酸残基，该残基位于孔道内并破坏经典的印防己毒素结合位点。这些结果解释了为何β亚基的掺入打破了受体对称性并改变了离子通道药理学特性。我们还发现了不完全受体复合物，并通过阐明其结构，首次揭示了部分组装的α三聚体和α四聚体的架构。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 天然甘氨酸受体的亚基化学计量比和组装机制是什么？
- 核心机制
- β亚基6'位苯丙氨酸（6'F）取代通常保守的6'苏氨酸（6'T），通过增加孔道内6'位点之间的距离和空间位阻来破坏印防己毒素结合，从而赋予异聚体受体对印防己毒素的敏感性丧失。
- 主要证据
- 通过冷冻电镜解析了天然异聚体（2.7 Å）和同聚体（4.1 Å）甘氨酸受体结构，鉴定异聚体化学计量比为4α:1β；同时观察到底物α三聚体和α四聚体中间体，电生理和FSEC实验证实α四聚体掺入第五个亚基时发生旋转和压实。
- 研究意义
- 为甘氨酸受体功能、药理学和组装机制提供了结构基础，有助于理解相关神经系统疾病（如惊跳病）的分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗甘氨酸受体α亚基3D1 Fab的制备
生成特异性区分α与β亚基的抗体片段，以利于冷冻电镜结构解析。
用斑马鱼α1同聚体免疫小鼠，获得杂交瘤细胞3D1，重组表达3D1 Fab，并通过FSEC筛选验证其与猪α1亚基结合特异性。
冷冻电镜数据采集与结构解析
获得天然甘氨酸受体各亚基化学计量状态的高分辨率三维结构。
将纯化的天然受体与3D1 Fab复合，进行冷冻电镜数据采集，并使用cryoSPARC进行2D/3D分类和精修，最终获得异聚体、同聚体、α四聚体和α三聚体的结构。
重组甘氨酸受体的表达与验证
验证天然受体化学计量比和组装中间体的生物学相关性。
在TSA201细胞中共表达猪α1和β亚基，使用FSEC检测热稳定性，并通过冷冻电镜分析重组受体，确认其化学计量比和亚基排列与天然受体一致。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | Affi-gel 10 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白表达 | pFastBacDual载体 | -- | -- |
| pEGBM载体 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Talon树脂 | Takara Bio | -- |
| 链霉亲和素树脂 | IBA Lifesciences | -- | |
| Superose6柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3探测器 | Gatan | -- | |
| Quantifoil 200目2/2金网 | Quantifoil | -- | |
| Vitrobot Mark III | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 抗甘氨酸受体α1抗体 | LSBio | LS-C335282 |
| 抗甘氨酸受体α2抗体 | GeneTex | GTX105634 | |
| 抗甘氨酸受体α3抗体 | MyBioSource | MBS621830 | |
| IRDye 680RD | LI-COR | -- | |
| IRDye 800CW | LI-COR | -- | |
| 配体结合实验 | 铜钇硅酸盐微珠 | PerkinElmer | -- |
| 甘氨酸 | -- | 56-40-6 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 天然受体提取与纯化 | 猪脊髓和脑干组织来源及处理细节；增溶和纯化条件（如下） 阅读提示：Methods中“Isolation of the native GlyRs”段落 |
| 冷冻电镜样品制备与数据采集 | 蛋白浓度（0.05 mg/mL）、甘氨酸添加浓度（20 mM）、网格类型（Quantifoil 200目金网）、碳膜厚度（2 nm）、电镜参数（Titan Krios，K3探测器，像素大小0.823 Å）、图像数量（17,472张） 阅读提示：Methods中“Cryo-EM sample preparation”和“Cryo-EM data analysis”段落 |
| 重组受体表达与验证 | 表达细胞系（TSA201）、表达载体（pEGBM）、感染MOI（2）、培养温度与时间（37°C感染，30°C培养48小时）、纯化方案（链霉亲和素树脂、Talon树脂、SEC） 阅读提示：Methods中“Porcine glycine receptor cloning, expression and purification”段落 |
| 配体结合实验 | 受体浓度（5 nM）、3H-士的宁浓度（1:4 3H:1H）、竞争配体甘氨酸浓度范围（10 nM-0.1 mM）、Fab添加浓度（50 nM） 阅读提示：Methods中“Ligand-binding assays”段落和Extended Data Fig. 1h-m |