GAG合酶的鉴定与基因敲除
确定GT4C是否为GAG合成所必需并构建GAG缺失菌株。
基于生物信息学分析，预测GT4C为GAG合酶；通过同源重组构建Δgt4c缺失菌株，并通过Southern blot验证；检测突变株的GAG产生（通过细胞壁糖组成分析和免疫荧光染色）以及黏附能力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
半乳糖胺半乳聚糖激活炎症小体以提供宿主保护
Galactosaminogalactan activates the inflammasome to provide host protection
实验完整度
高包含基因缺失菌株构建、体外巨噬细胞感染与转染、蛋白质互作与翻译抑制机制验证、小鼠曲霉病和结肠炎模型等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
烟曲霉野生型与Δgt4c、Δuge3、Δugm1、Δagd3突变株 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） C57BL/6小鼠（免疫缺陷和免疫健全模型） DSS诱导结肠炎小鼠模型
重点核对
烟曲霉菌株（WT、Δgt4c、Δuge3、Δugm1、Δagd3）及其GAG合成能力 BMDMs感染或转染GAG的剂量、时间（MOI 10，20小时；转染20 μg/mL，3小时） 体内感染模型中的免疫抑制处理（环磷酰胺和醋酸可的松）以及感染途径和剂量（鼻内1×10^5-10^6，静脉1×10^6） DSS诱导结肠炎模型中GAG给药剂量和途径（1 mg/kg，腹腔注射）
摘要
炎症小体是先天免疫防御的重要哨兵，可响应多种刺激（包括病原体相关分子模式（PAMPs））而被激活。炎症小体的激活提供了针对曲霉病的宿主防御，这是免疫受损患者的主要健康问题；然而，负责炎症小体激活的烟曲霉PAMPs尚不清楚。在这里，我们发现烟曲霉半乳糖胺半乳聚糖（GAG）是一种激活NLRP3炎症小体的新型PAMP。GAG与核糖体蛋白的结合抑制了细胞翻译机制，从而激活NLRP3炎症小体。半乳糖胺部分与核糖体蛋白结合并阻断细胞翻译，触发NLRP3炎症小体激活。在小鼠中，缺乏GAG的曲霉突变体Δgt4c未能引发保护性炎症小体激活，并表现出增强的毒力。此外，给予GAG以炎症小体依赖的方式保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。因此，核糖体将这种真菌PAMP的感知与先天免疫反应的激活联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 烟曲霉中激活炎症小体的PAMP是什么，以及其激活机制和宿主保护作用如何？
- 核心机制
- GAG的半乳糖胺部分通过电荷相互作用与核糖体蛋白结合，抑制细胞翻译并诱导内质网应激，从而激活NLRP3炎症小体。
- 主要证据
- 在BMDMs中，GAG转染诱导caspase-1 cleavage和细胞死亡，且NLRP3依赖；GAG与核糖体蛋白相互作用（如RPL14），抑制翻译；翻译抑制剂（anisomycin、puromycin、cycloheximide）类似地激活NLRP3炎症小体；体内实验中，Δgt4c菌株在小鼠中表现增强毒力，GAG给药在DSS结肠炎模型中提供保护。
- 研究意义
- 该研究揭示了核糖体作为细胞溶质传感器感知真菌PAMP并驱动炎症小体激活的新范式，为理解抗真菌先天免疫提供了新机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外巨噬细胞感染模型验证GAG对炎症小体激活的作用
比较不同GAG产生能力的烟曲霉菌株诱导BMDMs炎症小体激活的差异。
用WT、Δgt4c、Δuge3、Δugm1和Δagd3菌株感染BMDMs，检测caspase-1 cleavage、IL-1β释放和NF-κB/ERK信号通路激活情况。
GAG的胞内递送与炎症小体激活
确定胞质GAG是否足以激活炎症小体及其特异性受体。
用DOTAP将GAG、脱乙酰GAG或乙酰化GAG转染入BMDMs，检测caspase-1 cleavage和细胞死亡；使用NLRP3、AIM2和GSDMD基因敲除的BMDMs确定炎症小体依赖性。
GAG与核糖体蛋白互作及翻译抑制
揭示GAG激活NLRP3的分子机制，尤其是与核糖体的相互作用和翻译抑制。
通过多糖pull-down和质谱鉴定GAG相互作用蛋白；验证GAG与特定核糖体蛋白（RPL6、RPL7a、RPL14）互作；检测转染GAG后BMDMs的翻译速率（puromycin掺入）和多聚核糖体谱；并测试翻译抑制剂对NLRP3激活的影响。
体内验证GAG介导的炎症小体激活对宿主保护的作用
评估GAG介导的炎症小体激活在曲霉病和结肠炎模型中的生理相关性。
在免疫抑制和免疫健全小鼠中比较WT与GAG相关突变株的毒力和存活率；在DSS结肠炎模型中给予GAG或对照，评估体重变化、结肠长度和炎症指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Gibco | 12440-053 |
| 胎牛血清 | Biowest | S1620 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11995-065 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 脂多糖 | Invivogen | tlrl-smlps | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | |
| 药物处理 | 茴香霉素 | Cayman Chemical | 11308 |
| 嘌呤霉素 | Invivogen | ant-pr-1 | |
| 转染 | DOTAP转染试剂 | Roche | 11202375001 |
| Xfect转染试剂 | Takara | 631318 | |
| poly(dA:dT) | Invivogen | tlrl-patn | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | tlrl-epstfla | |
| 凝胶多糖 | Sigma | C7821 | |
| MG132蛋白酶体抑制剂 | Sigma Aldrich | M8699 | |
| 细胞死亡分析 | Sytox Green染料 | Thermo Fisher Scientific | S7020 |
| 免疫印迹 | caspase-1抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 |
| p-IκBα抗体 | Cell Signaling | 2859 | |
| t-IκBα抗体 | Cell Signaling | 9242 | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling | 9101 | |
| t-ERK抗体 | Cell Signaling | 9102 | |
| NLRP3抗体 | Adipogen | AG-20B-0006 | |
| pro-IL-1β抗体 | Cell Signaling | 12507 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling | 8H10D10 | |
| RPL6抗体 | ABclonal | A15094 | |
| RPL7a抗体 | ABclonal | A14060 | |
| RPL14抗体 | ABclonal | A6724 | |
| p-PERK抗体 | Cell Signaling | 3179S | |
| t-PERK抗体 | Cell Signaling | 3192 | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling | 3294S | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling | 3933S | |
| 嘌呤霉素抗体 | EMD Millipore | MABE343 | |
| HRP标记二抗（抗兔） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| HRP标记二抗（抗小鼠） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| HRP标记二抗（抗山羊） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-035-003 | |
| PVDF膜 | EMD Millipore | -- | |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| SYBR Green | Applied Biosystems | 4368706 | |
| 细胞因子分析 | 多因子ELISA试剂盒 | Millipore | MCYTOMAG-70K |
| 小鼠IL-1β未包被ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-703-88 | |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS618-3TEN | |
| 免疫荧光 | 抗GAG单克隆抗体 | -- | -- |
| 抗兔Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A32723 | |
| DAPI | Biotium | -- | |
| DDX3X抗体 | Bethyl Laboratories | A300-474A | |
| G3BP1抗体 | Proteintech | 66486-1-Ig | |
| 动物实验 | 环磷酰胺一水合物 | Sigma | C0768 |
| 醋酸可的松 | Sigma | C3130 | |
| 葡聚糖硫酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 9011-18-1 | |
| 显微镜 | Nikon C2共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| JEOL JSM 6700F场发射扫描电子显微镜 | JEOL | -- | |
| 细胞死亡分析 | IncuCyte Zoom活细胞成像系统 | Essen Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 真菌菌株与培养 | 菌株：A1160、Δgt4c、Δugm1、AF293、Δagd3、Δuge3；培养条件：2%麦芽/2%琼脂斜面，1周；孢子收集：0.1% Tween 20水溶液 阅读提示：METHODS：Aspergillus strain and culture |
| BMDMs培养与感染 | BMDMs来源：小鼠骨髓细胞，GM-CSF分化6天；感染：MOI 10，20小时；培养基：DMEM或IMDM，10% FBS 阅读提示：METHODS：In vitro stimulation of BMDMs |
| GAG转染实验 | 多糖浓度：20 μg/mL；转染试剂：DOTAP；转染时间：3小时；检测：caspase-1 cleavage, cell death 阅读提示：METHODS：Ligand transfection into BMDMs |
| 翻译抑制检测 | puromycin掺入：10 μg/mL，10分钟；检测：抗puromycin免疫印迹 阅读提示：METHODS：Translation rate of BMDMs |
| 多聚核糖体分析 | 细胞数：12×10^6；转染后1小时；蔗糖梯度：5%-50%；离心：133,000 ×g，2小时，4°C 阅读提示：METHODS：Polysome profiling |
| 动物感染模型 | 免疫抑制：环磷酰胺150 mg/kg腹腔注射，醋酸可的松112 mg/kg皮下注射，感染前2天和感染当天；感染剂量和途径：免疫抑制肺曲霉病鼻内1×10^5-10^6；免疫健全肺模型鼻内10^8；全身模型静脉10^6 阅读提示：METHODS：In vivo A. fumigatus infection |
| DSS结肠炎模型 | DSS浓度：3%（w/v）饮用水7天；GAG给药：1 mg/kg腹腔注射，每日一次，共7天；检测：体重、结肠长度、细胞因子 阅读提示：METHODS：In vivo DSS-induced colitis |