构建 ABC 增强子-基因图谱
预测 131 种生物样本中的增强子-基因连接
使用 ABC 模型，结合染色质可及性（ATAC-seq 或 DNase-seq）和 H3K27ac ChIP-seq 数据，计算每个候选元件与基因的 ABC 评分，并定义增强子-基因连接。
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全基因组增强子图谱将风险变异与疾病基因联系起来
Genome-wide enhancer maps link risk variants to disease genes
实验完整度
高包含基于131种生物样本的ABC图谱构建、CRISPRi-FlowFISH功能验证、CRISPRi-qPCR验证、THP1细胞线粒体膜电位测定及GWAS变异富集分析等多层级实验验证。
主要模型
THP1 细胞系（单核细胞样） BJAB 细胞系（B 细胞样） Jurkat 细胞系（T 细胞样） GM12878 细胞系（淋巴母细胞样） 原代免疫细胞（单核吞噬细胞、T 细胞亚群、树突状细胞等）
重点核对
CRISPRi 实验中使用的 gRNA 靶向序列和阴性对照 LPS 刺激条件（浓度和时间） 细胞系种类（THP1、BJAB、Jurkat、GM12878 等） ABC 模型预测的增强子-基因连接评分阈值（ABC score ≥0.015） 线粒体膜电位检测使用 MitoTracker Red 和 MitoTracker Green
摘要
全基因组关联研究（GWAS）现已确定了数千个与人类疾病和复杂性状相关的非编码位点，其中每一个都可能揭示疾病的生物学机制。许多潜在的因果变异被认为影响增强子，但我们缺乏准确的增强子及其靶基因图谱来解释这些变异。我们之前开发了活性-接触（ABC）模型来预测增强子-基因连接，并证明它可以预测跨多种细胞类型的CRISPR扰动结果。在这里，我们应用该ABC模型在131种细胞类型和组织中创建增强子-基因图谱，并使用这些图谱来解释GWAS变异的功能。在72种疾病和复杂性状中，ABC将5036个GWAS信号与2249个独特基因联系起来，其中包括一类577个基因，这些基因似乎通过在不同细胞类型中起作用的增强子变异影响多种表型。对于炎症性肠病（IBD），因果变异在特定细胞类型的预测增强子中富集超过20倍，ABC在将非编码变异连接到靶基因方面优于其他调控方法。在这些变异到功能的图谱指导下，我们证明含有IBD风险变异的增强子调节PPIF的表达，以调整巨噬细胞中的线粒体膜电位。总之，我们的研究揭示了基因组调控原理的见解，阐明了影响IBD的机制，并展示了一种将常见疾病风险变异与其分子和细胞功能联系起来的通用策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用增强子-基因图谱将 GWAS 风险变异与靶基因和细胞类型联系起来，并阐明其在疾病中的作用机制？
- 核心机制
- ABC 模型通过结合增强子活性和三维接触频率预测增强子-基因连接；在 IBD 风险位点 10q22.3，一个增强子中的风险变异 rs1250566 调节 PPIF 表达，进而影响巨噬细胞的线粒体膜电位（Δψm）。
- 主要证据
- ABC 图谱预测增强子-基因连接，CRISPRi-FlowFISH 和 CRISPRi-qPCR 验证了 PPIF 增强子（e-PPIF）对 PPIF 表达的调控，且 CRISPRi 敲低 e-PPIF 或 PPIF 启动子可改变 THP1 细胞在 LPS 刺激下的 Δψm。
- 研究意义
- 该研究构建了超过 600 万个增强子-基因连接的全基因组图谱，为解读非编码 GWAS 变异提供资源，并展示了从变异到功能的研究策略，可加速疾病基因和细胞类型的发现。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检验 ABC 图谱的准确性
验证 ABC 预测的增强子-基因连接是否与实验扰动结果一致
将 ABC 预测与 CRISPRi-FlowFISH 实验数据进行比较，计算精确率-召回率曲线下面积（AUPRC）。
富集分析 GWAS 变异
评估与疾病相关的遗传变异在 ABC 增强子中的富集程度
对 72 种疾病和复杂性状的精细映射变异（PIP ≥ 10%）与 ABC 增强子进行重叠分析，计算富集倍数。
预测靶基因
将非编码 GWAS 信号连接到候选靶基因
对于每个 trait，将精细映射变异与富集生物样本中的 ABC 增强子取交集，并将每个可信集分配给具有最高 ABC 分数的基因（ABC-Max）。
功能验证 PPIF 增强子
验证预测的 PPIF 增强子是否调节 PPIF 表达以及线粒体功能
在 PPIF 周围 712 Kb 区域内，使用 CRISPRi-FlowFISH 扰动所有可及元件，鉴定调节 PPIF 表达的增强子；随后在 THP1 细胞中用 CRISPRi 靶向 PPIF 增强子或启动子，检测 MitoTracker Red 信号变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清（热灭活） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖（大肠杆菌 K12） | Invivogen | -- |
| 佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯 | Sigma | -- | |
| 抗 CD40 抗体 | Invitrogen | -- | |
| 抗 IgM 抗体 | Sigma | -- | |
| 抗 CD3 抗体 | Biolegend | -- | |
| ATAC-seq | 细胞核分离 EZ 裂解缓冲液 | SIGMA | -- |
| 转座酶 TDE1 | Illumina | 15028212 | |
| SPRI 磁珠 | Agencourt | A63881 | |
| NEBNext HiFi 2x PCR 预混液 | NEB | M0541 | |
| ChIP-seq | 甲醛 | Thermo Scientific | 28906 |
| H3K27ac 抗体 | Active Motif | 39685 | |
| 蛋白 A 磁珠 | Invitrogen | 10008D | |
| 蛋白 G 磁珠 | Life Technologies | 10004D | |
| 蛋白酶 K | Invitrogen | 25530-049 | |
| 核糖核酸酶 A | Roche | 111199150001 | |
| Agencourt Ampure XP SPRI 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| KAPA 文库制备试剂盒 | KAPA Biosystems | KK8202 | |
| CRISPRi-FlowFISH | PrimeFlow 分析 | ThermoFisher | 88-18005-210 |
| KRAB-dCas9-IRES-BFP 载体 | Addgene | 85449 | |
| qPCR 验证 | SYBR Green I 预混液 | Roche | -- |
| 线粒体膜电位检测 | MitoTracker Red 染料 | Thermo Fisher | M7512 |
| MitoTracker Green 染料 | Thermo Fisher | M7514 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与培养 | 细胞系种类（THP1, BJAB, Jurkat, GM12878, U937），培养基（RPMI-1640），FBS 浓度（10% 或 15%），补充剂（L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素） 阅读提示：Methods: Immune cell lines, Cell culture |
| 刺激条件 | 刺激物及浓度（anti-CD40, anti-IgM, anti-CD3, PMA, LPS），刺激时间（4 小时） 阅读提示：Methods: Stimulation conditions for ABC maps and CRISPRi experiments |
| ATAC-seq 实验 | 细胞数量（50,000），裂解缓冲液（Nuclei Isolation EZ），转座酶（TDE1），PCR 循环数（15） 阅读提示：Methods: ATAC-seq |
| H3K27ac ChIP-seq | 细胞数量（5 百万），甲醛交联（1%），抗体（Anti-H3K27ac），磁珠（Protein A/G），测序深度（>30 百万 reads） 阅读提示：Methods: H3K27ac ChIP-seq |
| CRISPRi-FlowFISH | gRNA 文库，细胞系，KRAB-dCas9 表达，刺激条件，PrimeFlow 探针，FACS 分箱（6 箱），数据分析（最大似然估计） 阅读提示：Methods: CRISPRi-FlowFISH |
| 线粒体膜电位检测 | THP1 细胞，CRISPRi gRNA 池（靶向 e-PPIF, PPIF 启动子, 对照），MitoTracker Red/Green 浓度（200 nM），刺激（LPS 或 PMA+LPS），流式分选（3 箱） 阅读提示：Methods: Assessing the effect of PPIF and e-PPIF on mitochondrial membrane potential |