建立肿瘤模型
在体内生成具有不同结构的肿瘤（BCC型芽和SCC型折叠）。
使用低滴度慢病毒在E9.5胚胎单层表皮中表达Cre重组酶，激活SmoM2或HRasG12V致癌基因，生成了基底细胞癌（SmoM2）和鳞状细胞癌（HRasG12V）模型。
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多层上皮的力学特性决定肿瘤结构和功能
Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠遗传模型（SmoM2/HRasG12V）、AFM力学测量、RNA-seq转录组、计算模拟等多层次验证，并有功能验证（shRNA敲降）和机制验证。
主要模型
SmoM2（基底细胞癌）小鼠模型 HRasG12V（鳞状细胞癌）小鼠模型 SCC/BCC患者肿瘤组织
重点核对
基因型：SmoM2 vs HRasG12V 驱动的皮肤癌模型 基底膜刚度：通过shCol4a1、shHspg2、shPxdn调节 基底膜组装率：通过shLamb1或外源LN-511调节 细胞增殖：p27Kip1过表达或EdU标记 肿瘤进展：shCol4a1对HRasG12V肿瘤从乳头状瘤到SCC的加速作用
摘要
正常组织结构的丧失是致癌转化的标志之一。在发育生物体中，组织形态在形态发生过程中由机械力塑造。然而，肿瘤发生过程中组织结构的起源和后果仍不清楚。在皮肤中，癌前基底细胞癌形成“芽”，而侵袭性鳞状细胞癌则以“折叠”形式起始。在此，我们利用计算建模、遗传操作和生物物理测量，确定了这些肿瘤结构的生物物理基础及其生物学后果。细胞增殖和肌动球蛋白收缩性在单层而非多层上皮中主导组织结构。同时，在分层表皮中，基底膜的软化和增强重塑促进肿瘤出芽，而基底膜的硬化则促进折叠。额外的关键力来源于祖细胞的分层和分化。当致癌病变向恶性肿瘤进展时，会产生肿瘤特异性的上层基底刚度梯度，我们通过计算预测这将改变肿瘤基底膜上的延伸张力。这一预测的病理生理影响是深远的。在基因上降低基底膜的刚度会增加计算机模拟中的膜张力，并在体内增强侵袭性鳞状细胞癌的进展。我们的研究结果表明，从多层上皮祖细胞上方和下方施加的机械力成形癌前肿瘤结构并影响肿瘤进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 皮肤多层上皮中，哪些生物物理机制决定基底细胞癌出芽和鳞状细胞癌折叠的不同组织结构，并影响肿瘤进展？
- 核心机制
- 基底膜刚度降低和组装率增加促进出芽（BCC），而基底膜刚度增加和组装率降低促进折叠（SCC）；上层分化细胞产生的刚度梯度进一步改变基底膜张力，影响肿瘤侵袭。
- 主要证据
- 通过计算模型预测，AFM测量基底膜刚度，shRNA敲降改变刚度或组装，以及体内肿瘤进展实验（shCol4a1加速SCC）验证。
- 研究意义
- 揭示多层上皮肿瘤形态发生的力学机制，为理解肿瘤侵袭和进展提供新视角，可能指导治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
量化肿瘤形态
定量区分不同肿瘤形态。
通过免疫荧光和组织学染色，测量基底凹陷深度（IB）、曲率半径（φc）等参数，计算形状因子S来区分芽状和折叠状结构。
分析细胞增殖作用
确定增殖是否负责组织变形。
通过EdU标记检测增殖，并通过过表达p27Kip1抑制增殖，观察对病变大小和形态的影响。
测量细胞间张力
检测细胞间张力是否影响肿瘤形态。
进行激光消融实验测量细胞边界回缩速度，并用免疫荧光检测肌动球蛋白分布。
建立计算模型
模拟多层上皮中肿瘤形态发生的力学机制。
基于顶点模型，包含基底膜刚度、组装率和细胞增殖参数，模拟不同条件对肿瘤形状的影响。
测定基底膜力学特性
测量肿瘤中基底膜的刚度和组装率。
使用AFM测量基底膜刚度，通过荧光标记层粘连蛋白掺入率测量组装率。
验证基底膜力学调控作用
验证基底膜刚度和组装率对肿瘤形态的功能影响。
使用shRNA敲低Col4a1、Lamb1等基因改变基底膜力学特性，观察对肿瘤形态的影响。
评估上层细胞刚度梯度
检测上层分化细胞刚度是否影响肿瘤形态。
通过AFM测量不同表皮层的刚度，并利用KLHL16使角蛋白降解降低上层细胞刚度，观察对形态的影响。
体内肿瘤进展实验
确定基底膜刚度变化对肿瘤进展的影响。
在HRasG12V模型中敲低Col4a1，监测肿瘤从乳头状瘤到SCC的进展。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 293FT细胞 | Thermo Fisher Scientific | ue |
| 病毒生产 | pLKO.1载体 | -- | -- |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pPAX2 | Addgene | 12260 | |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | VWR | -- |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | -- | |
| Leica低温恒温器 | Leica | -- | |
| 染色 | Click-iT Alexa Fluor 647成像试剂盒 | Thermofisher | -- |
| 抗体 | 大鼠抗RFP抗体 | Chromotek | 5F8 |
| 兔抗RFP抗体 | MBL | PM005 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 山羊抗P-钙黏蛋白抗体 | R&D | AF761 | |
| 兔抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 9835 | |
| 大鼠抗E-钙黏蛋白抗体 | M. Takeichi | -- | |
| 豚鼠抗K14抗体 | Fuchs laboratory | -- | |
| 兔抗K10抗体 | Covance | poly19054 | |
| 兔抗IV型胶原抗体 | Abcam | ab6586 | |
| 大鼠抗巢蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | ELM1 | |
| 大鼠抗层粘连蛋白-β1抗体 | Abcam | LT3 | |
| 兔抗层粘连蛋白-α5抗体 | J. Miner | -- | |
| 兔抗层粘连蛋白-332抗体 | P. Marinkovich | -- | |
| 小鼠抗磷酸化S22肌球蛋白轻链2抗体 | Cell Signaling Technology | 3675 | |
| 小鼠抗波形蛋白抗体 | Dako | 3B4 | |
| 大鼠抗Sca-1抗体 | Becton Dickinson | D7 | |
| 染色 | 罗丹明-RRX鬼笔环肽 | Life Technologies | -- |
| 外植体培养 | PET Falcon细胞培养插入件 | Becton Dickinson | -- |
| Y-27632 | -- | -- | |
| 从EHS肿瘤中分离的层粘连蛋白 | Millipore | -- | |
| AlexaFluor647抗体标记试剂盒 | ThermoFisher | A20186 | |
| 罗丹明标记的层粘连蛋白 | Cytoskeleton Inc | LMN01-A | |
| 重组人LN-511 | BioLamina | -- | |
| 显微镜 | 转盘共聚焦系统 | Andor Technology | -- |
| Yokogawa CSU-W1 | Yokogawa Electric | -- | |
| Nikon TE2000-E倒置显微镜 | Nikon | -- | |
| Zeiss Axio Observer.Z1显微镜 | Zeiss | -- | |
| ApoTome.2 | Zeiss | -- | |
| 激光消融 | LSM 880 NLO激光扫描共聚焦和多光子显微镜 | Zeiss | -- |
| Chameleon Ultra II激光器 | Coherent Scientific | -- | |
| AFM | MFP-3D原子力显微镜 | Asylum Research | -- |
| 5微米直径球形尖端氮化硅悬臂 | Novascan | -- | |
| 电子显微镜 | 透射电子显微镜 | FEI | -- |
| 流式分选 | FACSAriaII | Becton Dickinson | -- |
| RNA提取 | Direct-zol RNA迷你制备试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNA-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina TrueSeq mRNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | Super-Script VILO cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Power SYBR green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型构建 | 小鼠基因型、慢病毒注射的时间（E9.5）和滴度 阅读提示：Methods: Mouse lines and lentiviral constructs |
| 形态量化 | 图像分析参数，包括形状因子S的计算方法 阅读提示：Methods: Quantification of tissue and cell morphology |
| 细胞增殖 | EdU标记时间和剂量、p27Kip1诱导条件 阅读提示：Methods: Quantification of cell proliferation; 图 Extended Data Fig. 2 |
| 激光消融 | 激光功率、扫描速度、帧频 阅读提示：Methods: Laser ablation |
| AFM测量 | 基底膜样品制备、探针类型、压入深度 阅读提示：Methods: Atomic force microscopy |
| 基底膜组装率 | 标记层粘连蛋白浓度、孵育时间、成像分析 阅读提示：Methods: Quantification of basement-membrane assembly |
| shRNA敲降 | shRNA序列、病毒滴度、敲低效率验证 阅读提示：Methods: shRNA sequences; 图 Extended Data Fig. 5f |
| 肿瘤进展 | 小鼠数量、观察时间、肿瘤取材标准 阅读提示：Methods: Adult tumour progression studies |