恢复期个体对SARS-CoV-2的趋同抗体反应

Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals

作者信息Davide F Robbiani, Christian Gaebler, Frauke Muecksch, Julio C C Lorenzi, Zijun Wang, Alice Cho, Marianna Agudelo, Christopher O Barnes, Anna Gazumyan, Shlomo Finkin, Thomas Hägglöf, Thiago Y Oliveira, Charlotte Viant, Arlene Hurley, Hans-Heinrich Hoffmann, Katrina G Millard, Rhonda G Kost, Melissa Cipolla, Kristie Gordon, Filippo Bianchini, Spencer T Chen, Victor Ramos, Roshni Patel, Juan Dizon, Irina Shimeliovich, Pilar Mendoza, Harald Hartweger, Lilian Nogueira, Maggi Pack, Jill Horowitz, Fabian Schmidt, Yiska Weisblum, Eleftherios Michailidis, Alison W Ashbrook, Eric Waltari, John E Pak, Kathryn E Huey-Tubman, Nicholas Koranda, Pauline R Hoffman, Anthony P West Jr, Charles M Rice, Theodora Hatziioannou, Pamela J Bjorkman, Paul D Bieniasz, Marina Caskey, Michel C Nussenzweig
PMID32555388
期刊Nature
发布时间2020-08
DOI10.1038/s41586-020-2456-9

实验完整度

高

包含患者队列血浆分析、单细胞抗体克隆、假病毒和真病毒中和实验、结构生物学(负染电镜)等多层级验证。

主要模型

COVID-19恢复期患者队列 RBD特异性记忆B细胞 SARS-CoV-2假病毒中和实验 293TACE2细胞

重点核对

血浆样本采集时间(症状出现后平均39天) 假病毒中和实验的NT50测定 单细胞测序的B细胞分选策略 单克隆抗体的中和活性(IC50) BLI竞争实验的抗体分组

摘要

在COVID-19大流行期间,SARS-CoV-2感染了数百万人,并夺去了数十万人的生命。病毒进入细胞依赖于SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的受体结合域(RBD)。尽管目前尚无疫苗,但抗体可能对保护至关重要。然而,目前关于人类对SARS-CoV-2的抗体反应知之甚少。在此,我们报告了149名COVID-19恢复期个体。在症状出现后平均39天采集的血浆,其半数最大假病毒中和滴度各异:33%低于1:50,79%低于1:1000,而只有1%显示滴度>1:5000。抗体测序显示,不同个体中表达密切相关抗体的RBD特异性记忆B细胞克隆扩增。尽管血浆滴度低,但针对RBD上三个不同表位的抗体以低至个位数ng/mL的半数最大抑制浓度(IC50s)中和病毒。因此,大多数从COVID-19康复的个体获得的恢复期血浆不包含高水平的中和活性。尽管如此,在所有测试个体中都发现了罕见但反复出现的具有强效抗病毒活性的RBD特异性抗体,这表明设计用于引发此类抗体的疫苗可能具有广泛有效性。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
COVID-19恢复期个体是否产生强效中和抗体,且这些抗体是否具有趋同性?
核心机制
恢复期个体中存在反复出现的针对RBD多个表位的强效中和抗体,其序列趋同,提示免疫系统可产生保守的抗体反应。
主要证据
通过单细胞测序从6个个体中分离出534对IgG序列,表达94个单克隆抗体,其中52个中和假病毒,3个强效抗体(C121、C135、C144)对真病毒IC50<5 ng/mL。
研究意义
疫苗若能选择性诱导针对RBD的此类抗体,可能具有广泛有效性。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

血浆抗体结合检测

评估恢复期血浆中抗RBD和S蛋白的IgG/IgM水平

使用ELISA检测149名恢复期个体的血浆样品对RBD和S蛋白的结合,归一化AUC。

2

血浆中和活性检测

测定恢复期血浆对SARS-CoV-2假病毒的中和滴度

使用携带nanoluc报告基因的HIV-1假病毒中和实验,测定NT50。

3

单细胞分选与抗体测序

分离RBD特异性记忆B细胞并获得配对抗体重链和轻链序列

通过流式细胞术分选RBD结合B细胞,进行单细胞RT-PCR和测序。

4

单克隆抗体表达及结合特性

验证单克隆抗体的RBD结合能力及交叉反应性

表达94个代表性抗体,ELISA测定EC50,并测试与SARS-CoV及其他冠状病毒RBD的交叉反应。

5

单克隆抗体中和活性

评估单克隆抗体对SARS-CoV-2假病毒和真实病毒的中和能力

对89个抗体进行假病毒中和实验,对3个抗体进行真实病毒中和实验,测定IC50。

6

表位竞争实验

确定中和抗体识别的RBD表位是否不同

使用生物层干涉技术进行抗体竞争实验,将抗体分为3组。

7

负染电镜结构分析

解析抗体与S蛋白复合物的结构,支持表位分组

对C002、C119、C121 Fabs与S三聚体复合物进行nsEM成像和重建。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
pTwist-CMV BetaGlobin载体Twist Bioscience Technologies--
Expi293F细胞Thermo Fisher--
Ni2+-NTA亲和层析GE Life Sciences--
Superdex200 16/60柱GE Life Sciences--
96孔半孔板Corning3690
抗人IgG-HRPJackson Immuno Research109-036-088
抗人IgM-HRPJackson Immuno Research109-035-129
TMB底物ThermoFisher--
FluoStar Omega酶标仪BMG Labtech--
聚乙烯亚胺----
荧光素酶细胞裂解液5xPromega--
Nano-Glo荧光素酶检测系统Promega--
Modulus II微板阅读器TURNER BioSystems--
DMEM培养基----
胎牛血清----
抗SARS-CoV-2核衣壳抗体GeneTexGTX135357
山羊抗兔AlexaFluor 594Life TechnologiesA-11012
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
生物素蛋白连接酶-BIRA试剂盒Avidity--
EZ-Link Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒Thermo Scientific--
链霉亲和素-PEBD biosciences554061
链霉亲和素-AF647Biolegend405237
泛B细胞分选试剂盒Miltenyi Biotec130-101-638
抗CD20-PECy7BD Biosciences335793
抗CD3-APC-eFluor 780Invitrogen47-0037-41
抗CD8-APC-eFluor 780Invitrogen47-0086-42
抗CD16-APC-eFluor 780Invitrogen47-0168-41
Zombie NIR染料BioLegend423105
SuperScript III逆转录酶Invitrogen18080-044
RNasin核糖核酸酶抑制剂PromegaN2615
Octet Red仪器ForteBio--
蛋白A生物传感器ForteBio18-5010
Talos Arctica透射电子显微镜Thermo Fisher--
K3直接电子探测器Gatan, Inc--
甲酸铀酰----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
血浆采集与处理
参与者纳入标准、症状出现至采样时间(平均39天)、血浆热灭活条件(56°C 1小时)
阅读提示:Methods: Study participants, Blood samples processing and storage
ELISA检测
包被浓度1μg/mL、起始稀释度1:200、二抗稀释度1:5000、TMB底物孵育10分钟
阅读提示:Methods: ELISAs; Figure 1 legend
假病毒中和实验
血浆5倍系列稀释、单抗4倍系列稀释、293TACE2细胞感染48小时
阅读提示:Methods: Pseudotyped virus neutralization assay; Figure 2 legend
单细胞分选
分选表型CD20+CD3-CD8-CD16-Ova-RBD+、抗体浓度和孵育时间
阅读提示:Methods: Single cell sorting by flow cytometry; Extended Data Fig. 6
单克隆抗体中和实验
真病毒中和实验VeroE6细胞MOI~0.1 PFU/细胞、感染18小时
阅读提示:Methods: Microscopy-based neutralization assay of authentic SARS-CoV-2; Figure 4 legend