血浆抗体结合检测
评估恢复期血浆中抗RBD和S蛋白的IgG/IgM水平
使用ELISA检测149名恢复期个体的血浆样品对RBD和S蛋白的结合,归一化AUC。
Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals
包含患者队列血浆分析、单细胞抗体克隆、假病毒和真病毒中和实验、结构生物学(负染电镜)等多层级验证。
COVID-19恢复期患者队列 RBD特异性记忆B细胞 SARS-CoV-2假病毒中和实验 293TACE2细胞
血浆样本采集时间(症状出现后平均39天) 假病毒中和实验的NT50测定 单细胞测序的B细胞分选策略 单克隆抗体的中和活性(IC50) BLI竞争实验的抗体分组
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估恢复期血浆中抗RBD和S蛋白的IgG/IgM水平
使用ELISA检测149名恢复期个体的血浆样品对RBD和S蛋白的结合,归一化AUC。
测定恢复期血浆对SARS-CoV-2假病毒的中和滴度
使用携带nanoluc报告基因的HIV-1假病毒中和实验,测定NT50。
分离RBD特异性记忆B细胞并获得配对抗体重链和轻链序列
通过流式细胞术分选RBD结合B细胞,进行单细胞RT-PCR和测序。
验证单克隆抗体的RBD结合能力及交叉反应性
表达94个代表性抗体,ELISA测定EC50,并测试与SARS-CoV及其他冠状病毒RBD的交叉反应。
评估单克隆抗体对SARS-CoV-2假病毒和真实病毒的中和能力
对89个抗体进行假病毒中和实验,对3个抗体进行真实病毒中和实验,测定IC50。
确定中和抗体识别的RBD表位是否不同
使用生物层干涉技术进行抗体竞争实验,将抗体分为3组。
解析抗体与S蛋白复合物的结构,支持表位分组
对C002、C119、C121 Fabs与S三聚体复合物进行nsEM成像和重建。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pTwist-CMV BetaGlobin载体 | Twist Bioscience Technologies | -- |
| Expi293F细胞 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni2+-NTA亲和层析 | GE Life Sciences | -- |
| Superdex200 16/60柱 | GE Life Sciences | -- | |
| ELISA | 96孔半孔板 | Corning | 3690 |
| 抗人IgG-HRP | Jackson Immuno Research | 109-036-088 | |
| 抗人IgM-HRP | Jackson Immuno Research | 109-035-129 | |
| TMB底物 | ThermoFisher | -- | |
| FluoStar Omega酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 假病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 假病毒中和 | 荧光素酶细胞裂解液5x | Promega | -- |
| Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| Modulus II微板阅读器 | TURNER BioSystems | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 活病毒中和 | 抗SARS-CoV-2核衣壳抗体 | GeneTex | GTX135357 |
| 山羊抗兔AlexaFluor 594 | Life Technologies | A-11012 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| 流式分选 | 生物素蛋白连接酶-BIRA试剂盒 | Avidity | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉亲和素-PE | BD biosciences | 554061 | |
| 链霉亲和素-AF647 | Biolegend | 405237 | |
| 泛B细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-638 | |
| 抗CD20-PECy7 | BD Biosciences | 335793 | |
| 抗CD3-APC-eFluor 780 | Invitrogen | 47-0037-41 | |
| 抗CD8-APC-eFluor 780 | Invitrogen | 47-0086-42 | |
| 抗CD16-APC-eFluor 780 | Invitrogen | 47-0168-41 | |
| Zombie NIR染料 | BioLegend | 423105 | |
| 抗体测序 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080-044 |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2615 | |
| BLI | Octet Red仪器 | ForteBio | -- |
| 蛋白A生物传感器 | ForteBio | 18-5010 | |
| 负染电镜 | Talos Arctica透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan, Inc | -- | |
| 甲酸铀酰 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆采集与处理 | 参与者纳入标准、症状出现至采样时间(平均39天)、血浆热灭活条件(56°C 1小时) 阅读提示:Methods: Study participants, Blood samples processing and storage |
| ELISA检测 | 包被浓度1μg/mL、起始稀释度1:200、二抗稀释度1:5000、TMB底物孵育10分钟 阅读提示:Methods: ELISAs; Figure 1 legend |
| 假病毒中和实验 | 血浆5倍系列稀释、单抗4倍系列稀释、293TACE2细胞感染48小时 阅读提示:Methods: Pseudotyped virus neutralization assay; Figure 2 legend |
| 单细胞分选 | 分选表型CD20+CD3-CD8-CD16-Ova-RBD+、抗体浓度和孵育时间 阅读提示:Methods: Single cell sorting by flow cytometry; Extended Data Fig. 6 |
| 单克隆抗体中和实验 | 真病毒中和实验VeroE6细胞MOI~0.1 PFU/细胞、感染18小时 阅读提示:Methods: Microscopy-based neutralization assay of authentic SARS-CoV-2; Figure 4 legend |