复合物表达与纯化
获得用于结构解析和生化分析的KSR:MEK1和BRAF:MEK1复合物。
使用杆状病毒表达系统在SF21细胞中共表达人KSR1/2、BRAF与兔MEK1，通过钴树脂亲和、离子交换和凝胶过滤层析纯化复合物。
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药物曲美替尼在KSR结合的MEK上作用的结构基础
Structural basis for the action of the drug trametinib at KSR-bound MEK
实验完整度
高包含晶体结构解析、细胞水平靶点结合实验（NanoBRET）、免疫共沉淀验证、体外结合动力学、细胞增殖和克隆形成等功能实验，以及CRISPR筛选数据分析，多个独立证据层级支持结论。
主要模型
KSR1:MEK1复合物 KSR2:MEK1复合物 BRAF:MEK1复合物
重点核对
KSR1/2与MEK1的共表达及复合物纯化 曲美替尼及类似物在KSR结合MEK上的结合亲和力与驻留时间 KSR1和BRAF pre-helix αG loop突变对曲美替尼结合的影响 trametiglue在KRAS和BRAF突变细胞系中的抗增殖活性
摘要
MAPK/ERK激酶MEK是常见癌症驱动因子KRAS和BRAF的共同效应分子，长期以来一直是肿瘤学，以及最近的免疫疗法和衰老领域中药物靶点。然而，许多MEK抑制剂（MEKi）由于靶向毒性以及耐药性而受到限制。因此，对生理复合物中MEK结构和功能的分子理解可以为设计更安全、更有效的疗法提供模板。在此，我们报道了MEK与支架蛋白KSR（Ras激酶抑制因子）结合并与多种MEKi（包括临床药物曲美替尼）结合的X射线晶体结构。这些结构揭示了一种意想不到的结合模式，其中曲美替尼直接与KSR在MEK界面处结合。通过复合物形成，KSR重塑了典型的MEKi变构口袋，从而影响结合和动力学，包括药物驻留时间。此外，曲美替尼与KSR-MEK结合，但通过一种利用区分这些亚复合物的进化保守界面残基的机制，破坏相关的RAF-MEK复合物。基于这些见解，我们创造了trametiglue，它通过增强界面结合来限制对MEKi的适应性耐药。总之，我们的结果揭示了MEK亚复合物内界面口袋的可塑性，这对设计靶向RAS通路的下一代药物具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 曲美替尼在KSR结合的MEK复合物中的结合模式及其与RAF-MEK复合物选择性差异的分子机制，以及如何利用这些机制设计更有效的MEK抑制剂。
- 核心机制
- 曲美替尼通过其独特的苯乙酰胺基团（C区）直接结合KSR的pre-helix αG loop，而RAF的对应区域因空间位阻阻碍其结合，从而实现对KSR-MEK复合物的选择性结合并破坏RAF-MEK复合物。
- 主要证据
- 通过X射线晶体结构解析KSR1/2:MEK1与不同MEKi的复合物，结合NanoBRET细胞内靶点结合实验和免疫共沉淀验证，发现曲美替尼直接接触KSR并延长驻留时间，而RAF-MEK因pre-helix αG loop的差异而被破坏。
- 研究意义
- 本研究揭示了MEK亚复合物中界面口袋的可塑性，为设计靶向RAS通路的下一代药物提供了框架，并开发了trametiglue作为策略来克服MEKi的适应性耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
晶体结构解析
确定MEKi（包括曲美替尼）与KSR:MEK1复合物结合的详细分子结构。
将KSR1/2:MEK1复合物与MEKi共结晶，通过X射线衍射收集数据，并用分子置换法解析结构。
细胞内靶点结合分析
在活细胞中测量MEKi与MEK以及KSR-bound MEK的结合亲和力和驻留时间。
使用NanoBRET技术，表达MEK1-Nanoluc和KSR1-Nanoluc融合蛋白，用tram-bo作为荧光示踪剂进行竞争实验和洗脱实验。
免疫共沉淀验证
验证曲美替尼对KSR1-MEK和BRAF-MEK复合物稳定性的影响，以及pre-helix αG loop突变的作用。
在HCT116细胞中转染野生型或突变型KSR1、BRAF，用MEK1抗体进行免疫共沉淀，检测MEK1与KSR1或BRAF的结合。
体外结合动力学
测量曲美替尼与不同MEK复合物的结合亲和力和驻留时间。
使用生物层干涉技术，将生物素化的曲美替尼固定在传感器上，测量其与游离MEK1、BRAF:MEK1、KSR1:MEK1、KSR2:MEK1的结合动力学。
细胞增殖和功能验证
评估trametiglue相对于曲美替尼在癌细胞模型中的抗增殖活性和对RAS-MAPK信号通路的影响。
在多种KRAS和BRAF突变细胞系中进行细胞活力测定和克隆形成实验，并分析磷酸化ERK水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pFastBac Dual表达载体 | -- | -- |
| 钴树脂 | Clontech | -- | |
| 蛋白纯化 | HiPrep SP HP柱 | GE Healthcare | -- |
| HiPrep Q HP柱 | GE Healthcare | -- | |
| 晶体学 | AMP-PNP | -- | -- |
| 曲美替尼 | Selleckchem | S2673 | |
| 考比替尼 | Selleckchem | S8041 | |
| 司美替尼 | Selleckchem | S1008 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| Western blot | MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4694S |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| 磷酸化ERK1/2 (T202/Y204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101S | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| BRAF抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5284 | |
| FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗鼠HRP抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 抗兔HRP抗体 | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| 免疫沉淀 | MEK1抗体 | Millipore-Sigma | 07-641 |
| 正常兔IgG | Millipore-Sigma | 12-370 | |
| Western blot | Precision Plus蛋白双色标准品 | Bio-Rad | 1610375 |
| 分子生物学 | QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞裂解 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78440 |
| 蛋白定量 | BCA试剂 | Pierce | 23225 |
| 免疫沉淀 | Sepharose蛋白A树脂 | Thermo Fisher | 53139 |
| Western blot | 4-12% Bis-Tris甘氨酸凝胶 | Bio-Rad | 3450125 |
| MOPS-SDS缓冲液 | Thermo Fisher | NP0001 | |
| 细胞增殖 | Corning Costar超低附着96孔板 | Corning | 3434 |
| 刃天青钠盐 | -- | -- | |
| NanoBRET | Fugene HD转染试剂 | Promega | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985-070 | |
| NanoLuc抑制剂 | Promega | -- | |
| Nano-Glo底物 | Promega | -- | |
| GloMax酶标仪 | Promega | -- | |
| 曲美替尼-氟硼荧衍生物 | -- | -- | |
| shRNA敲低 | KSR1-shRNA构建体 | Addgene | 1864 |
| Lenti-X浓缩器 | Takara | 631231 | |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara | 631280 | |
| qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Superscript IV第一链合成系统 | Invitrogen | 18091050 | |
| Power SYBR-Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| BLI | Octet Red96系统 | ForteBio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白复合物纯化 | KSR1:MEK1、KSR2:MEK1和BRAF:MEK1的共表达条件，包括宿主细胞、感染时间和纯化缓冲液组成 阅读提示：Methods: Expression and purification of KSR:MEK1 and BRAF:MEK1 complexes |
| 晶体学结构解析 | 复合物浓度、AMP-PNP浓度、结晶缓冲液条件、MEKi浸泡浓度和晶体冷冻条件 阅读提示：Methods: Crystallization and structure determination of inhibitor-bound KSR1/2:MEK1 complexes |
| NanoBRET靶点结合 | 细胞转染量、tram-bo浓度、MEKi浓度范围、孵育时间和洗脱实验中的预处理浓度 阅读提示：Methods: Intracellular target engagement assays via NanoBRET |
| 免疫共沉淀 | 细胞系、转染量、药物处理浓度和时间、抗体用量、裂解缓冲液成分 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation of MEK1 associated complexes from cancer cell lines |
| BLI结合动力学 | 缓冲液成分、生物素化trametinib固定量、蛋白浓度范围和实验温度 阅读提示：Methods: Binding analysis as measured by bio-layer interferometry (BLI) |