细胞外TMEJ报告系统分析
确定TMEJ修复所需的步骤及nuclease类型。
将不同修饰（如硫代磷酸酯）的DNA底物电转染入细胞，通过qPCR定量TMEJ修复效率。
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θ介导末端连接中聚合酶δ和θ的分步需求
Stepwise requirements for polymerases δ and θ in theta-mediated end joining
实验完整度
高结合体外生化实验、细胞外染色体外底物实验、细胞内Cas9染色体报告系统和超分辨成像等多种证据层级，并通过功能分离突变体验证机制。
主要模型
RPE1细胞 POLQ−/− RPE1细胞 MEF细胞 U2OS细胞
重点核对
Polθ抑制：2μM ART558处理 Polδ敲低：shPOLD1或siPOLD1处理 Polδ活性位点突变：ExoM、PolM、PIPM等 TMEJ底物：具有不同flap长度及合成长度的底物 染色体报告系统：LBR基因座Cas9诱导DSB
摘要
及时修复染色体双链断裂对于基因组完整性和细胞活力至关重要。聚合酶θ介导的末端连接（TMEJ）通路在解决这些断裂中具有重要作用，并且在其他DNA修复通路缺陷的癌症中是必需的，因此是一个新兴的治疗靶点。它需要退火2–6个与断裂末端相邻的互补序列核苷酸——微同源序列——然后由聚合酶θ启动桥接DNA合成。然而，其他通路步骤仍未被充分定义，并且所需酶尚不清楚。在此，我们展示了在聚合酶θ启动合成之前，还需要对未配对的3'尾进行外切消化，然后切换到更准确、更具持续性且能置换链的聚合酶来完成修复。我们展示了复制型聚合酶δ对这两个步骤都是必需的；其3'至5'外切酶活性用于切除flap，其聚合酶活性用于延伸和完成修复。对该通路必需且特有的酶促步骤由两种聚合酶的两次独立、顺序参与介导。这些步骤的必要偶联可能由两种聚合酶的物理关联促进。聚合酶δ与能够进行桥接合成的聚合酶θ的这种配对，可能有助于解释为什么通常高保真的聚合酶δ参与基因组去稳定过程，如有丝分裂DNA合成和微同源介导的断裂诱导复制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TMEJ通路在Polθ启动合成之前和之后需要哪些酶促步骤，以及哪些酶参与这些步骤？
- 核心机制
- TMEJ需要Polθ介导微同源序列配对和起始合成，随后由Polδ的外切酶活性切除未配对的3'端flap，再由Polδ在PCNA辅助下进行持续性和链置换合成以完成修复，两种聚合酶通过物理相互作用顺序参与。
- 主要证据
- 通过体外切除实验、细胞外染色体外底物实验和染色体报告系统，使用Polδ功能分离突变体，证明外切酶活性负责flap切除，聚合酶活性负责持续性合成，并通过Co-IP和超分辨成像证实Polδ与Polθ相互作用。
- 研究意义
- 揭示了TMEJ通路的完整机制，为靶向Polθ的癌症治疗提供了新见解，并解释了高保真Polδ参与基因组去稳定过程的原因。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Polδ功能分离突变体分析
确定Polδ各催化活性在TMEJ两个步骤中的作用。
在Polδ敲低细胞中表达野生型或突变体POLD1，检测不同TMEJ底物的修复效率。
体外生化实验验证
确认Polδ外切酶活性可以切除flap，并测定其活性。
使用纯化的人Polδ和带有不同长度3'单链突出端的DNA底物，进行体外切除反应，通过凝胶电泳分析产物。
染色体报告系统分析
验证Polδ在染色体TMEJ中的必要性。
利用Cas9在LBR基因座引入DSB，通过qPCR或数字PCR定量不同修复产物。
蛋白相互作用分析
验证Polδ与Polθ的物理相互作用。
通过免疫共沉淀和微尺度热泳动检测Polδ与Polθ或其结构域的相互作用。
超分辨成像分析
证实损伤后Polδ与Polθ在DNA损伤位点的共定位。
使用STORM成像观察Polδ、Polθ和53BP1的定位，并进行三重相关分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| McCoy's培养基 | Corning | -- | |
| DMEM-F12培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | VWR, Seradigm | -- | |
| 青霉素 | Sigma | -- | |
| 转染 | Transporter 5转染试剂 | Polysciences | -- |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 细胞处理 | ART558（Polθ抑制剂） | Artios Pharma | -- |
| DNA提取 | QIAamp DNA小量提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | TaqMan Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | -- |
| 蛋白纯化 | 直链淀粉树脂 | NEB | -- |
| Hi-Trap SP柱 | Cytiva | -- | |
| Histrap树脂 | Cytiva | -- | |
| 蛋白分析 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| POLD1抗体 | Abcam | ab186406 | |
| 肌动蛋白抗体 | Novus | NB600-535 | |
| Halo抗体 | Promega | G9211 | |
| POLE抗体 | GeneTex | GTX132100 | |
| FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| APEX2抗体 | Novus | NB100-56625 | |
| POLD2抗体 | Thermo Scientific | PA5-55401 | |
| POLD3抗体 | Abcam | ab182564 | |
| PCNA抗体 | Santa Cruz | SC-56 | |
| Vinculin抗体 | Santa Cruz | SC-25336 | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 免疫共沉淀 | 磁珠 | BioRad | 1614013 |
| 新制癌菌素 | Sigma | -- | |
| 体外反应 | 苯甲酸酶 | Sigma | -- |
| 细胞处理 | EdU | -- | -- |
| 超分辨成像 | Janelia Fluor 646 halo-tag配体 | Promega | GA1120 |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma | G2133 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma | C3155 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 巯基乙胺 | Fisher Scientific | BP2664100 | |
| POLD1抗体 | Santa Cruz | sc-17776 | |
| 53BP1抗体 | Novus | NB100-304 | |
| AF488二抗 | Invitrogen | -- | |
| AF568二抗 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | DAPI | -- | -- |
| AF647叠氮化物 | -- | -- | |
| 测序 | Illumina Iseq 100 i2试剂盒 | Illumina | -- |
| PhiX对照DNA | Illumina | -- | |
| AMPure磁珠 | Beckman | -- | |
| 试剂 | dTTP | -- | -- |
| dGTP | -- | -- | |
| dCTP | -- | -- | |
| dATP | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 细胞选择 | 杀稻瘟菌素 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | RPE1细胞是否p53−/−，是否Polθ敲除，MEF细胞来源，U2OS细胞Polθ敲除状态 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines |
| Polδ功能抑制 | shPOLD1或siPOLD1的序列、转导/转染效率，以及POLD1突变体（ExoM, PolM, PIPM等）是否表达 阅读提示：Materials and Methods: Generation of recombinant cell lines, siRNA knockdown; Figure 2b, Extended data Fig. 2f,g |
| TMEJ底物设计 | 微同源长度、flap长度、合成的核苷酸长度，以及底物是否带有修饰（如硫代磷酸酯） 阅读提示：Materials and Methods: Extrachromosomal assays; Figure 1a, b; Supplementary Tables 2, 3 |
| Polθ抑制 | ART558浓度（2μM）和处理时间（2小时） 阅读提示：Materials and Methods: Extrachromosomal assays, Figure legends |
| 染色体报告系统 | Cas9靶向序列、LBR位点，修复产物定量方法（qPCR/ddPCR），参考扩增子 阅读提示：Materials and Methods: Cas9 chromosomal reporter assay; Supplementary Table 6 |
| 体外生化实验 | Polδ纯化方法，底物序列和长度，反应缓冲液组成，Polδ与底物浓度及反应时间 阅读提示：Materials and Methods: In vitro assays; Figure 2e; Supplementary Table 4 |
| 蛋白相互作用分析 | 免疫共沉淀中抗体、洗涤步骤，MST中Polθ ΔCen浓度和标记，缓冲液组成 阅读提示：Materials and Methods: Co-IP, Microscale thermophoresis; Figure 4 |
| 超分辨成像 | NCS处理浓度和时间，Halo配体浓度，抗体浓度，成像和分析参数 阅读提示：Materials and Methods: Super resolution imaging and analysis; Extended data Fig. 8 |