鉴定HCV RNA 5'端FAD帽
确定HCV RNA 5'末端是否存在FAD帽及其化学性质。
使用FAD特异性酶AtNUDX23进行CapZyme-seq，检测HCV(+)和HCV(-) RNA的5'端，并进行LC-MS/MS定量FAD。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丙型肝炎病毒RNA的5'端带有黄素腺嘌呤二核苷酸帽
Hepatitis C virus RNA is 5'-capped with flavin adenine dinucleotide
实验完整度
高包含CapZyme-seq、LC-MS/MS、RT-qPCR reduction assay、体外NS5B复制起始实验、细胞感染实验、体内人肝嵌合小鼠实验以及患者样本分析等多层级验证，且进行了功能与机制研究。
主要模型
Huh7.5细胞感染HCV J6/JFH1重组病毒 Huh7.5细胞转染亚基因组复制子JFH1-SGR-Feo HCV感染的人肝嵌合uPA-SCID小鼠 慢性HCV感染患者血浆样本
重点核对
HCV J6/JFH1感染Huh7.5细胞后，RNA 5'FAD帽的比例约为75%（CapZyme-seq定量） LC-MS/MS检测RNA中FAD，感染组显著高于未感染组 NS5B体外复制起始反应中，FAD作为起始核苷酸产生FAD-C产物 5'FAD RNA在A549报告细胞中不激活RIG-I介导的IFN-β反应 患者血浆中基因2a和3a HCV RNA检测到FAD帽，1a为5'ppp
摘要
RNA病毒已进化出复杂的策略来保护其基因组，包括5'加帽。然而，迄今为止尚未发现丙型肝炎病毒（HCV）的RNA 5'帽，该病毒可导致慢性感染、肝硬化和癌症。在此，我们证明细胞代谢物黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）被病毒RNA依赖性RNA聚合酶用作非经典起始核苷酸，导致HCV RNA上形成5'FAD帽。HCV FAD加帽频率约为75%，这是所有生物界中观察到的任何RNA代谢物帽的最高频率。FAD加帽在HCV分离株中保守，存在于复制中间体负链以及部分正链上。在从患者血清以及人肝嵌合小鼠模型的肝脏和血浆中分离的HCV RNA上也观察到这种现象。此外，我们表明5'FAD加帽保护RNA免受RIG-I介导的先天免疫识别，但不稳定HCV RNA。这些结果确立了细胞代谢物加帽作为一种新型病毒RNA加帽策略，该策略可能被其他病毒使用，并影响病毒治疗结果和感染的持续性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCV RNA的5'末端是否具有代谢物帽，以及这种帽对病毒复制和免疫逃逸的作用是什么？
- 核心机制
- HCV NS5B聚合酶以FAD作为非经典起始核苷酸进行从头复制起始，产生5'FAD帽；该帽保护病毒RNA免受RIG-I介导的先天免疫识别，但不影响RNA稳定性。
- 主要证据
- 通过CapZyme-seq检测到J6/JFH1 HCV RNA的5'FAD帽（约75%），LC-MS/MS验证FAD存在，体外NS5B复制起始反应证实FAD参与起始，细胞实验显示5'FAD RNA不激活RIG-I而5'ppp激活。
- 研究意义
- 首次鉴定病毒RNA的5'代谢物帽，可能代表一种普遍的病毒策略，为抗病毒治疗提供新靶点，并影响病毒持久性和治疗结局。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FAD帽的体内存在
验证FAD帽在体内感染中是否出现。
从人肝嵌合uPA-SCID小鼠的肝脏和血浆以及患者血浆中提取RNA，通过RT-qPCR reduction assay检测FAD帽。
评估FAD帽的保守性
检测不同基因型HCV分离株是否具有FAD帽。
对基因1-6型HCV感染细胞进行CapZyme-seq和RT-qPCR reduction assay，分析FAD帽的保守性。
研究FAD对复制的影响
测试FAD或核黄素缺乏对HCV复制的影响。
在核黄素缺乏的培养基中培养Huh7.5细胞，转染HCV复制子，比较不同基因型的复制效率，并观察补充FAD或核黄素的效果。
验证NS5B起始使用FAD
证实HCV NS5B聚合酶能以FAD为起始核苷酸进行RNA合成。
进行体外复制起始反应，使用重组NS5B和RNA模板，加入FAD和标记核苷酸，检测起始产物。
测试FAD帽的免疫逃逸功能
研究FAD帽是否保护RNA免于先天免疫识别。
将5'FAD或5'ppp RNA转染至A549报告细胞，检测IFN-β启动子活性、免疫相关基因表达，并使用siRNA敲低RIG-I验证。
比较基因型间免疫诱导差异
比较具有5'ppp的1a基因型与具有5'FAD的2a基因型在感染早期诱导先天免疫的差异。
感染HepG2-HFL和A549/pr(IFNβ).GFP细胞，检测IFNB1、IFNL1等基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩试剂盒-5 | Zymo Research | R1013 |
| RNA清洁与浓缩试剂盒-25 | Zymo Research | R1017 | |
| 酶处理 | RNA 5'多磷酸酶 | Lucigen | RP8092H |
| Terminator 5'磷酸依赖性外切酶 | Lucigen | TER51020 | |
| 拟南芥Nudix水解酶23 | -- | -- | |
| Cap-Clip酸性焦磷酸酶 | CELLSCRIPT | C-CC15011H | |
| 体外转录 | MEGAscript T7转录试剂盒 | Invitrogen | AM1334 |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM1907 | |
| LC-MS/MS | 核酸酶P1 | Sigma | -- |
| 苯zonase核酸酶 | Santa Cruz Biotech | -- | |
| 碱性磷酸酶 | Sigma | -- | |
| 13C5-FAD内标 | Medical Isotopes, Inc. | -- | |
| 安捷伦1290 Infinity II超高效液相色谱 | Agilent Technologies | -- | |
| 安捷伦6495三重四极杆质谱 | Agilent Technologies | -- | |
| NS5B纯化 | HisTrap HP纯化柱 | Cytiva | -- |
| PD10脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| Q5热启动高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| 复制起始反应 | 黄素腺嘌呤二核苷酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 3'脱氧鸟苷三磷酸 | Jena Biosciences | -- | |
| 鸟苷三磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胞苷三磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尿苷三磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 奈斯布韦 | Acme Biosciences | -- | |
| 贝拉布韦 | Acme Biosciences | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668027 | |
| 荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 | |
| 核黄素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 光黄素 | Cayman | -- | |
| 细胞培养 | 杀稻瘟菌素 | Invivogen | -- |
| 博来霉素 | Invivogen | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma | -- | |
| RNA稳定性实验 | Xrn1外切核酸酶 | NEB | M0338L |
| 鼠RNase抑制剂 | NEB | M0314 | |
| 免疫测定 | 聚肌胞苷酸 | Sigma | P1530 |
| RIG-I小干扰RNA | ThermoFisher Scientific | s223615 | |
| MDA5小干扰RNA | ThermoFisher Scientific | s34499 | |
| 抗NS5A单克隆抗体(9E10) | Cell Essentials | -- | |
| Core抗体(C7-50) | Enzo Life Sciences Inc | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Santa Cruz | sc-24948 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling | 4947 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling | 3033 | |
| 抗RIG-I抗体 | Abcam | ab180675 | |
| 抗MDA5抗体 | Cell Signaling | 5321T | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 增强化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | 34579 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | BioRad | -- | |
| 流式细胞术 | FACSMelody流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| RNA测序 | Illumina NextSeq550测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CapZyme-seq | 使用的酶（AtNUDX23、Rpp等）的来源、浓度和处理时间；RNA起始量；文库构建的PCR循环数 阅读提示：Methods: CapZyme-seq |
| LC-MS/MS定量FAD | RNA酶解条件（Nuclease P1浓度）、内标（13C5-FAD）用量、色谱质谱参数 阅读提示：Methods: Quantification of FAD using LC-MS/MS |
| NS5B体外复制起始 | NS5B蛋白浓度、RNA模板序列、FAD和NTP浓度、3' dGTP使用、标记核苷酸种类 阅读提示：Methods: NS5B de novo replication initiation assay |
| 核黄素缺乏实验 | 核黄素缺乏培养基的制备（rdRPMI）、透析FBS（rdFBS）的制备、FAD或核黄素补充浓度、转染后检测时间点 阅读提示：Methods: Replication assays |
| 免疫逃逸实验 | 报告细胞系（A549/pr(IFNβ).GFP、A549-Dual）、RNA转染量、siRNA敲低效率、感染MOI和检测时间 阅读提示：Methods: A549 reporter cell experiments; Methods: Innate immune response during HCV infection |