丘脑驱动斑胸草雀求偶鸣唱中的发声起始

Thalamus drives vocal onsets in the zebra finch courtship song

作者信息Felix W Moll, Devorah Kranz, Ariadna Corredera Asensio, Margot Elmaleh, Lyn A Ackert-Smith, Michael A Long
PMID36949189
期刊Nature
发布时间2023-04
DOI10.1038/s41586-023-05818-x

实验完整度

包含行为扰动实验(Uva/HVC刺激与损毁)、体内双光子钙成像(轴突与胞体)、药理学或电生理验证、组织学及多种数据分析方法,多层证据支持结论。

主要模型

成年雄性斑胸草雀(Taeniopygia guttata) HVC premotor neurons (HVCRA) HVCX和HVCInterneurons Uva-HVC轴突

重点核对

Uva电刺激参数(5脉冲,500Hz,100μA,0.2ms/相) HVC神经元分类标准(activation ratio和k-means聚类) 植入电极位置验证(组织学) 行为刺激电流强度(根据个体调整) 成像分析方法(NoRMCorre运动校正)

摘要

虽然运动皮层回路包含与特定运动参数相关的信息,但长程输入在动作执行中也起着关键作用。丘脑投射可以塑造运动前活动,并被认为可能介导构成更复杂行为的简短、刻板动作的选择。然而,丘脑与运动皮层回路相互作用以执行此类运动序列的机制仍然未知。本研究发现,丘脑驱动能够激活斑胸草雀鸣唱核团HVC(专有名称)内一个特定的运动前神经元亚群,并且这些输入对于发声运动元件(即‘音节’)之间的进程至关重要。对HVC中丘脑轴突的体内双光子成像揭示了强烈的鸣唱相关活动,而对丘脑功能的在线扰动导致鸣唱在音节边界处被截断。我们使用丘脑刺激来识别HVC中一组稀疏的丘脑驱动神经元,约占该网络内运动前神经元的15%。令人惊讶的是,这个推定的丘脑接收神经元群体在音节起始前立即强烈活跃,表明丘脑输入可能通过选择性靶向这些‘起始细胞’来启动单个鸣唱组分。我们的发现强调运动丘脑在行为相关序列背景下作为皮层动力学的指挥者。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
丘脑Uva核如何与HVC皮层回路相互作用以执行斑胸草雀鸣唱序列?
核心机制
Uva通过选择性驱动HVC中约15%的运动前神经元(UvD细胞),在音节起始前~25ms激活,从而启动音节,而非持续反馈。
主要证据
行为学显示Uva刺激在音节边界截断鸣唱,而HVC刺激则在全曲截断;双光子成像显示UvD神经元活动集中在发声起始前,且Uva刺激诱发短潜伏期反应。
研究意义
揭示运动丘脑通过特异性连接到皮层‘起始细胞’来启动复杂运动序列的机制,与人类言语和呼吸协调的潜在类比,为运动序列的丘脑启动理论提供生物学例证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立Uva功能必要性

验证Uva在成年鸣唱产生中的必要性及对音节结构的影响。

对Uva进行单侧或双侧损毁或假损毁,分析损毁后鸣唱声音图谱和音节结构变化,使用t-SNE可视化和PCA进行聚类分析。

2

行为扰动验证Uva参与音节起始

测试Uva在线刺激对鸣唱进行的影响,区分‘快速反馈模型’与‘起始模型’。

在鸣唱期间对双侧Uva或HVC进行电刺激(5脉冲,500Hz,20-120μA),分析鸣唱截断时间与音节边界的对应关系。

3

Uva-HVC轴突形态与数量分析

量化Uva直接投射到HVC的神经元数量,并观察轴突与HVC神经元的突触连接。

使用逆行示踪(CTB和GFP病毒)计数UvaHVC神经元;使用顺行标记(AAV9-CAG-GFP)观察HVC中Uva轴突分布和膨体。

4

Uva轴突在HVC中的功能性成像

检测HVC投射的Uva神经元在发声过程中的活性模式。

在Uva表达GCaMP6s,使用双光子成像记录HVC中Uva轴突的钙活动,比较不同类型发声(鸣唱、引导音、叫声)下的响应。

5

功能分类HVC神经元为UvD和nUvD

基于Uva刺激的响应,识别HVC中受丘脑驱动的神经元亚群。

在HVC中表达GCaMP6s,同时给予Uva电刺激,计算每个神经元的‘激活比例’和ΔF/F,使用k-means聚类分为UvD和nUvD。

6

UvD和nUvD神经元在鸣唱中的活性分析

比较UvD和nUvD神经元在鸣唱中的放电时间模式,验证UvD是否集中在发声起始。

分析UvD和nUvD神经元在鸣唱中的钙事件时间,使用贝叶斯推断估计放电事件时间,并统计与发声起始/结束的对齐分布。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
A-M Systems 2100型脉冲发生器A-M Systems2100
RX8数字信号处理器Tucker-Davis Technologies--
铁三角AT803全指向麦克风Audio-Technica--
Presonus Studio Channel电子管前置放大器Presonus--
Chameleon钛蓝宝石激光器Coherent--
H10770PA-40光电倍增管模块Hamamatsu--
奥林巴斯XLPLN25XWMP水浸物镜Olympus--
Nanoject III显微注射器Drummond Scientific--
加州精细电线California Fine Wire--
MicroProbes电极MicroProbesPI20030.5B3
Kwik-Sil粘合剂WPI--
Kwik-Cast硅弹性体WPI--
Vectashield防淬灭封片剂Vector Laboratories--
抗GFP抗体(A-11122)ThermoFisherA-11122
抗NeuN抗体(MAB377)SigmaMAB377
抗tdT抗体(AB8181-200)OriGeneAB8181-200
蔡司LSM800共聚焦显微镜Zeiss--
VT1200S振动切片机Leica--
铁三角AT831麦克风Audio-Technica--
百灵达Ultragain Pro MIC2200前置放大器Behringer--
Wantai 57BYGH420-2步进电机Wantai57BYGH420-2
Arduino UNO开发板Arduino--
NResearch电磁阀NResearch--
ScanImage 4.2软件----
NoRMCorre运动校正算法----
MATLAB软件MathWorks--
Kilosort尖峰分类软件----
Phy手动后处理软件----
Digidata 1550数模转换器Molecular Devices--
Clampex采集软件----
葡聚糖Alexa Fluor 488(D22910)InvitrogenD22910
霍乱毒素B亚单位Alexa Fluor 647偶联物(C34778)InvitrogenC34778
AAV9-CAG-GFP病毒(37825-AAV9)Addgene37825-AAV9
AAV9-FLEX-tdTomato病毒(28306-AAV9)Addgene28306-AAV9
AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40病毒(100844)Addgene100844
RetroBeads逆行示踪微球Lumafluor Inc.--
Diagnostic Biochips 128-5硅探针Diagnostic Biochips--
磷酸盐缓冲液----
正常驴血清----
Triton X-100----
DAPI染料----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
Uva损毁/刺激电极植入
Uva坐标、电极类型、电流强度、损毁时间
阅读提示:Methods: Surgical procedures; Chronic implanted bipolar electrodes
电生理刺激参数
刺激脉冲数、频率、电流大小、刺激持续时间,Uva刺激和HVC刺激的差异
阅读提示:Methods: Song-triggered Microstimulation; Figure 1 legend
病毒注射与示踪
病毒类型、注射体积、注射位点、潜伏期时间
阅读提示:Methods: In vivo stereotaxic injections
双光子成像
GCaMP6s表达、成像帧率、激光波长、ROI选择
阅读提示:Methods: 2-Photon Imaging; 2-photon imaging data analysis
HVC神经元分类
Uva刺激次数、激活比例计算、k-means聚类参数
阅读提示:Methods: Data Analysis: Uva stimulation evoked ΔF/F; Figure 3 legend