开发Cap2检测方法
建立转录组范围内定量和定位Cap2的方法
开发CapTag-seq用于定量整体Cap2水平，开发CLAM-Cap-seq用于定位特定mRNA上的Cap2，并通过CMTR2 KO细胞验证特异性。
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mRNA老化塑造哺乳动物mRNA中的Cap2甲基化组
mRNA ageing shapes the Cap2 methylome in mammalian mRNA
实验完整度
高包含方法开发（CapTag-seq、CLAM-Cap-seq、CapOligo-PAGE）、细胞模型（HEK293T、A549、MCF-7、mES）、基因敲除（CMTR2 KO、RIG-I KO）、组学分析（RNA-seq、TSS-seq、polysome-TSS-seq、actD-TSS-seq）和功能验证（RIG-I pulldown、VSV感染）。
主要模型
HEK293T细胞 A549细胞 MCF-7细胞 小鼠胚胎干细胞
重点核对
CMTR2敲除（KO）HEK293T和A549细胞系 CMTR2、RIG-I双敲除A549细胞系 RIG-I过表达及突变体（K858A/K861A） CMTR2过表达及突变体（W85A） VSV感染模型（propagation-incompetent VSV replicon）
摘要
mRNA帽结构是mRNA动态甲基化的主要位点。mRNA帽以Cap1或Cap2形式存在，分别取决于第一个转录核苷酸或第一和第二个转录核苷酸上是否存在2'-O-甲基化。然而，含Cap2的mRNA的身份以及Cap2的功能尚不清楚。在这里，我们描述了CLAM-Cap-seq，一种用于转录组范围内定位和定量Cap2的方法。我们发现与其他表观转录组修饰不同，Cap2可以出现在所有mRNA上。Cap2是通过mRNA在细胞质中老化时从Cap1缓慢连续转化为Cap2而形成的。因此，Cap2富集于长寿命mRNA上。Cap1丰度的大幅增加导致RIG-I的激活，尤其是在RIG-I表达增加的情况下。Cap1甲基化为Cap2显著降低了RNA结合并激活RIG-I的能力。Cap2的缓慢甲基化速率使得Cap2能够在宿主mRNA上积累，同时确保新表达的病毒RNA上Cap2水平较低。总之，这些结果揭示了Cap1的免疫刺激作用，以及Cap2的功能是减少先天免疫反应的激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Cap2修饰在mRNA上的分布、形成机制及其生物学功能是什么？
- 核心机制
- Cap2是mRNA老化的标志，通过CMTR2在细胞质中缓慢催化Cap1向Cap2转化，富集于长寿命mRNA；Cap2的双甲基化降低了RNA与RIG-I的结合能力，从而抑制先天免疫反应。
- 主要证据
- CapTag-seq和CLAM-Cap-seq显示Cap2广泛存在且随mRNA老化增加；BruChase实验证实Cap2随时间积累；RIG-I pulldown显示Cap2 RNA与RIG-I结合降低；CMTR2 KO细胞中ISG上调，RIG-I敲除可逆转；VSV感染中CMTR2过表达增加病毒RNA Cap2并抑制IP10诱导。
- 研究意义
- Cap2通过抑制内源性RNA激活RIG-I来维持免疫稳态，为理解自身与非己RNA识别机制提供新视角，并提出Cap1作为免疫刺激信号的潜在作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
绘制Cap2甲基化组
探究Cap2在不同细胞类型和序列背景中的分布
对mES、HEK293T、MCF-7细胞进行CLAM-Cap-seq，结合TSS-seq鉴定TSN亚型并计算Cap2 stoichiometry；分析不同m7G近端二核苷酸的Cap2水平。
分析Cap2与翻译和稳定性的关系
确定Cap2是否影响mRNA翻译和稳定性
采用polysome-TSS-seq测量翻译效率，采用actD-TSS-seq测量mRNA半衰期，比较不同Cap2水平mRNA的翻译和稳定性。
验证Cap2与mRNA年龄的关系
测试Cap2是否随mRNA老化而积累
使用BruChase标记新生RNA，通过CapTag-seq测量年轻和年老mRNA的Cap2水平；使用CLAM-Cap-qPCR测量特定mRNA随年龄的Cap2变化。
研究Cap2缺失对基因表达的影响
确定Cap2缺失对转录组的影响
对CMTR2 WT和KO HEK293T细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路富集；验证ISG上调。
评估Cap2对RIG-I激活的影响
探究Cap2是否通过抑制RIG-I结合来抑制免疫激活
进行RIG-I pulldown实验比较Cap1和Cap2 RNA的结合；在细胞中过表达RIG-I或CMTR2，测量IP10表达。
验证Cap2在病毒RNA上的作用
测试Cap2修饰是否影响病毒RNA诱导的免疫反应
使用VSV感染模型，在CMTR2过表达或对照细胞中测量病毒RNA Cap2水平和IP10表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录起始位点分析
mRNA稳定性分析
RNA代谢标记
蛋白质检测
RIG-I结合检测
细胞增殖检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| Ham's F-12K培养基 | Gibco | 21127022 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140076 | |
| 白血病抑制因子 | ESGRO | ESG1107 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
| PD0325901 | STEMCELL Technologies | 72182 | |
| 基因敲除 | FTSJD1双切口酶质粒 | Santa Cruz Biotechnology | SC-412604-NIC |
| RIG-I双切口酶质粒 | Santa Cruz Biotechnology | SC-400812-NIC | |
| 转染 | LipoD239转染试剂 | SignaGen Laboratories | SL100668 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 高冲击力氧化锆1.5毫米珠子 | Benchmark Scientific | D1032-15 | |
| TissueLyser II | Qiagen | -- | |
| mRNA提取 | Oligo(dT)25磁珠 | NEB | S1419S |
| RNA纯化 | Zymo Research Clean and Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 |
| CapTag-seq | Quick CIP | NEB | M0525L |
| Cap-Clip酸性焦磷酸酶 | CELLSCRIPT | C-CC15011H | |
| T4 RNA连接酶1 | NEB | M0437M | |
| RNaseOUT | -- | -- | |
| RNase T2 | MoBiTec | GE-NUC00400-02 | |
| M-280链霉亲和素Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201L | |
| T4 RNA连接酶2，截短KQ | NEB | M0373L | |
| 酵母5'脱腺苷酶 | NEB | M0331S | |
| RecJf | NEB | M0264S | |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080051 | |
| Phusion高保真PCR预混液 | NEB | M0531L | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| TSS-seq | RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 |
| ActD-TSS-seq | 果蝇poly(A)+ RNA | Takara | 636222 |
| Polysome-TSS-seq | Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78440 |
| CLAM-Cap-seq | Terminator 5'磷酸依赖性外切酶 | Lucigen | TER51020 |
| Maxima逆转录酶（RNase H阴性） | Thermo Scientific | EP0752 | |
| CircLigase II | -- | -- | |
| CapOligo-PAGE | T4 DNA连接酶 | Thermo Scientific | EL0011 |
| Monarch RNase A | NEB | T3018L | |
| BamHI HF | NEB | 3136L | |
| Novex TBE-尿素上样缓冲液 | Invitrogen | LC6876 | |
| BruChase | 5-溴尿苷 | Sigma | 850187 |
| 尿苷 | Sigma | U3750 | |
| 抗溴脱氧尿苷抗体 | MBL Life Science | MI-11-3 | |
| Pierce Protein A/G磁珠 | Thermo Scientific | 88802 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 25530049 | |
| Phase Lock Gel Heavy管 | QuantaBio | 2302830 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9515 | |
| RNA-seq | ERCC RNA加标混合物1 | Invitrogen | 4456740 |
| NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7770S | |
| NEBNext rRNA去除试剂盒 | NEB | E6310L | |
| Western blot | BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | NP0322BOX | |
| 兔抗FTSJD1多克隆抗体 | Invitrogen | PA5-61696 | |
| 兔抗RIG-I单克隆抗体 | CST | 3743T | |
| 兔抗RIG-I/DDX58单克隆抗体 | Abcam | ab180675 | |
| 兔抗MDA5单克隆抗体 | CST | 5321T | |
| 兔抗IFIT1单克隆抗体 | CST | 14769S | |
| 兔抗IFITM3 XP单克隆抗体 | CST | 59212T | |
| 小鼠抗NLRP1单克隆抗体 | BioLegend | 679802 | |
| 兔抗MAVS多克隆抗体 | CST | 3993T | |
| 兔抗OAS3多克隆抗体 | Abcam | ab154270 | |
| 小鼠抗嘌呤霉素单克隆抗体 | Millipore Sigma | MABE343 | |
| 小鼠抗GAPDH单克隆抗体 | GeneTex | GT239 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Thermo | AM4302 | |
| HRP标记的驴抗兔IgG | Cytiva | NA934 | |
| HRP标记的绵羊抗小鼠IgG | Cytiva | NA931 | |
| RT-qPCR | DNase I | Thermo Scientific | EN0521 |
| SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080051 | |
| 随机六聚体 | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo(dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1708880 | |
| MTT assay | MTT试剂 | Abcam | ab146345 |
| 细胞培养 | 多聚-D-赖氨酸 | Gibco | A3890401 |
| VSV感染 | pcDNA4.0/TO-NeonGreen质粒 | -- | -- |
| pcDNA4/TO-NeonGreen-CMTR2质粒 | -- | -- | |
| pcDNA4/TO-NeonGreen-CMTR2 W85A质粒 | -- | -- | |
| LipoD293T转染试剂 | -- | -- | |
| 免疫刺激 | 低分子量聚肌苷酸-聚胞苷酸 | InvivoGen | -- |
| 三磷酸发夹RNA | InvivoGen | -- | |
| LyoVec转染试剂 | InvivoGen | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1(+)-FLAG-RIG-I质粒 | OriGene | OHu25414 |
| RIG-I pulldown | 生物素标记双链RNA寡核苷酸 | TriLink Biotechnologies | -- |
| SYBR Gold核酸凝胶染料 | Invitrogen | S11494 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（培养基、血清、抗生素、生长因子） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| CMTR2敲除细胞系生成 | 敲除质粒、转染试剂、筛选方法（嘌呤霉素浓度和持续时间） 阅读提示：Methods: Generation of KO cell lines |
| CapTag-seq | mRNA起始量、酶处理（Quick CIP、Cap-Clip、RNase T2等）和缓冲液成分 阅读提示：Methods: CapTag-seq |
| CLAM-Cap-seq | mRNA起始量、片段化条件、逆转录酶和逆转录条件、CircLigase反应条件 阅读提示：Methods: CLAM-Cap-seq |
| BruChase | 5-BrU浓度、标记时间、尿苷追踪时间点、免疫沉淀抗体和条件 阅读提示：Methods: BruChase; BruChase-CapTag-seq |
| RNA-seq | RNA提取、文库制备试剂盒、测序平台、生物学重复数 阅读提示：Methods: RNA-seq; RNA-seq data analysis |
| RIG-I pulldown | dsRNA序列和修饰、细胞裂解条件、抗体和洗涤条件 阅读提示：Methods: Preparation of the biotinylated dsRNA oligos for RIG-I pulldown; RIG-I pulldown assay |
| VSV感染 | VSV复制子来源、感染复数、感染时间、转染条件（CMTR2质粒） 阅读提示：Methods: VSV infections |