Rpd3S复合物的表达与纯化
获得用于结构研究和生化分析的重组Rpd3S复合物。
在杆状病毒-昆虫细胞中共表达全长Rpd3, Sin3, Rco1, Eaf3和Ume1，并通过亲和纯化和凝胶过滤获得复合物。
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Rpd3S介导的H3K36me3引导的核小体去乙酰化的多种模式
Diverse modes of H3K36me3-guided nucleosomal deacetylation by Rpd3S
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、体外生化实验、酵母体内功能研究等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
酿酒酵母Rpd3S复合物 H3K36me3修饰的设计核小体 STE11-HIS3报告酵母菌株 H3K9R突变酵母菌株
重点核对
Rpd3S复合物包含两个Eaf3和两个Rco1拷贝，形成不对称结构 Eaf3 CHD结构域识别H3K36me3，Rco1 PHD1识别未修饰H3K4 Rpd3S催化中心定位在H4尾部附近，执行H4去乙酰化 PHD1突变（E260K/D261K）影响H3去乙酰化但不影响H4 左臂突变（Rco1 7mu）严重损害H3和H4去乙酰化，且对H4影响更强
摘要
上下文依赖性动态组蛋白修饰构成基因调控中的关键表观遗传机制。Rpd3小（Rpd3S）复合物识别组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化（H3K36me3），并在转录区域多个位点去乙酰化组蛋白H3和H4。本文解析了酿酒酵母Rpd3S在游离态和结合H3K36me3核小体状态下的冷冻电镜结构。我们展示了Rpd3S的独特结构，其中两个Eaf3-Rco1异二聚体不对称地与Rpd3和Sin3组装形成催化核心复合物。Eaf3、Sin3和Rco1对两个H3K36me3标记、核小体DNA和连接DNA的多价识别将Rpd3的催化中心定位到组蛋白H4 N端尾部附近进行去乙酰化。在另一种催化模式中，Rco1和Eaf3对未甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸和H3K36me3的组合读取指导组蛋白H3特异性去乙酰化，但注册的组蛋白H3乙酰化赖氨酸9除外。总的来说，我们的工作展示了Rpd3S多价核小体结合和甲基化引导去乙酰化的动态和多样模式，强调了在多亚基酶机器在转录及其他过程中精细调控表观遗传的精致复杂性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Rpd3S复合物如何结合H3K36me3核小体并实现位点特异性的去乙酰化？
- 核心机制
- Rpd3S通过两个Eaf3 CHD对H3K36me3的双价识别和Rco1 PHD1对未修饰H3K4的识别，引导Rpd3催化中心作用于特定组蛋白尾部，实现H3和H4的去乙酰化，同时避开H3K9ac。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示Rpd3S与H3K36me3核小体结合，生化实验表明特定突变影响去乙酰化活性，酵母体内实验显示相应表型。
- 研究意义
- 揭示了Rpd3S介导的组蛋白去乙酰化的结构机制，为理解类I HDAC复合物的调控和作用提供了框架，有助于开发基于结构的HDAC活性调节药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Rpd3S游离态结构解析
确定Rpd3S复合物的整体结构。
对纯化的Rpd3S复合物进行冷冻电镜分析，获得整体结构。
Rpd3S与H3K36me3核小体复合物结构解析
揭示Rpd3S如何结合H3K36me3核小体。
重组H3K36me3修饰的设计核小体，与Rpd3S混合，制备冷冻电镜样品，解析复合物结构。
体外去乙酰化活性检测
检验Rpd3S对不同组蛋白乙酰化位点的去乙酰化活性。
使用设计核小体底物，加入不同浓度的Rpd3S，通过Western blot检测特定乙酰化位点的去除。
酵母体内功能验证
验证Rpd3S突变体在体内的功能影响。
使用STE11-HIS3报告菌株进行斑点实验，检测突变体对隐性转录的影响；Western blot检测突变体对组蛋白乙酰化水平的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | Superose 6 Increase 5/150 GL 凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- |
| 冷冻电镜 | Titan Krios 透射电子显微镜 | FEI | -- |
| K3 探测器 | Gatan | -- | |
| Quantifoil 1.2/1.3 微栅 | -- | -- | |
| Vitrobot 冷冻制样仪 | FEI | -- | |
| 等温滴定量热 | MicroCal PEAQ-ITC 等温滴定量热仪 | Malvern Panalytical | -- |
| Western blot | PVDF 膜 | -- | -- |
| HDAC assay | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| 鲑鱼精DNA | -- | -- | |
| 交联质谱 | 双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯 | -- | -- |
| Thermo Orbitrap Fusion 质谱仪 | Thermo | -- | |
| Thermo-Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱系统 | Thermo | -- | |
| Western blot | 增强化学发光 | -- | -- |
| 抗H3K9ac抗体 | ABclonal | A7255 | |
| 抗H3K14ac抗体 | PTM BIO | PTM-157 | |
| 抗H3K18ac抗体 | PTM BIO | PTM-158 | |
| 抗H3K23ac抗体 | PTM BIO | PTM-115 | |
| 抗H3K27ac抗体 | PTM BIO | PTM-160 | |
| 抗H3K56ac抗体 | PTM BIO | PTM-162 | |
| 抗H3K36me3抗体 | PTM BIO | PTM-625 | |
| 抗H4K5ac抗体 | Sigma-Aldrich | 04-118 | |
| 抗H4K8ac抗体 | ABclonal | A7258 | |
| 抗H4K12ac抗体 | ABclonal | A22754 | |
| 抗H4K16ac抗体 | Cell Signaling Technology | 13534S | |
| 抗H4抗体 | PTM BIO | PTM-1009 | |
| 抗H3抗体 | ABclonal | A2348 | |
| 核小体重建 | 非洲爪蟾组蛋白 | -- | -- |
| EcoRV限制酶 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | Sf9昆虫细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Rpd3S复合物表达纯化 | 蛋白表达所用昆虫细胞系、共表达比例、纯化步骤 阅读提示：Methods: Protein expression and purification |
| 冷冻电镜样品制备 | Rpd3S与核小体摩尔比（15:5）、GraFix梯度条件、交联剂浓度 阅读提示：Methods: Sample preparation and cryo-EM data collection |
| HDAC活性检测 | 核小体底物浓度500 nM、酶浓度滴定、反应缓冲液成分、反应时间25分钟 阅读提示：Methods: HDAC assays |
| 酵母斑点实验 | 酵母菌株、质粒构建、细胞密度、培养基成分、6-AU浓度100 μg/ml 阅读提示：Methods: Spotting assays |
| 体内乙酰化检测 | 酵母菌株、培养条件、蛋白提取方法、Western blot抗体及稀释度 阅读提示：Methods: Western blotting |