模式化的cPCDH表达调控新皮层的精细组织

Patterned cPCDH expression regulates the fine organization of the neocortex

作者信息Xiaohui Lv, Shuo Li, Jingwei Li, Xiang-Yu Yu, Xiao Ge, Bo Li, Shuhan Hu, Yang Lin, Songbo Zhang, Jiajun Yang, Xiuli Zhang, Jie Yan, Alexandra L Joyner, Hang Shi, Qiang Wu, Song-Hai Shi
PMID36477535
期刊Nature
发布时间2022-12
DOI10.1038/s41586-022-05495-2

实验完整度

包含scRNA-seq分析、MADM谱系标记、功能缺失和过表达实验、电生理记录、体内发育时间点分析等多层级验证。

主要模型

小鼠新皮层兴奋性神经元克隆(MADM标记) Pcdhg-cKO小鼠模型 Pcdhgc3过表达小鼠模型

重点核对

E12时单次他莫昔芬诱导MADM标记 P14-21或P14-35进行表型分析 Pcdhg条件敲除或Pcdhgc3过表达 四重全细胞膜片钳记录 克隆神经元对的空间距离测量

摘要

新皮层由大量多样的神经元组成,这些神经元在单细胞分辨率下形成不同的层和复杂的回路,以支持复杂的大脑功能。多样化的细胞表面分子被认为是定义神经元身份和介导神经元间相互作用以进行结构和功能组织的关键。然而,控制新皮层精细神经元组织的精确机制仍 largely 不清楚。在这里,通过整合深入的单细胞RNA测序分析、祖细胞谱系标记和镶嵌功能分析,我们报告了聚集的原钙粘蛋白(cPCDHs)——钙粘蛋白超家族细胞粘附分子中最大的亚群——的多样但模式化的表达调控小鼠新皮层兴奋性神经元的精确空间排列和突触连接。单个新皮层兴奋性神经元中cPcdh基因的表达是多样的,但表现出与其发育起源和空间定位相关的独特组成模式。功能性cPCDH表达的减少导致起源于同一神经祖细胞的克隆相关兴奋性神经元发生侧向聚集,并显著增加突触连接。相反,过表达单个cPCDH亚型导致克隆相关兴奋性神经元的侧向分散,并显著减少突触连接。这些结果表明,模式化的cPCDH表达偏向于哺乳动物大脑中单个新皮层兴奋性神经元的精细空间和功能组织。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
模式化的cPCDH表达是否以及如何调控新皮层兴奋性神经元的精细空间排列和突触连接?
核心机制
cPCDH的多样但模式化的表达通过同嗜性相互作用介导神经元间的识别和排斥,从而影响克隆相关神经元的空间分布和突触连接;减少cPCDH功能导致聚集和连接增强,过表达单一亚型导致分散和连接减弱。
主要证据
通过MADM标记克隆神经元,结合scRNA-seq分析cPcdh表达,发现克隆相关神经元表达相似性更高;功能实验显示Pcdhg缺失导致侧向距离减小和突触连接率升高,Pcdhgc3过表达导致侧向距离增大和突触连接率降低。
研究意义
揭示了cPCDH表达作为分子调控框架,影响新皮层兴奋性神经元单细胞水平的结构和功能组织,为理解大脑复杂回路形成提供新视角。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

克隆标记与cPcdh表达分析

建立MADM系统标记神经祖细胞克隆,探究克隆相关神经元中cPcdh的表达模式及其与谱系和空间位置的关系。

使用Emx1-CreERT2;MADM系统在E12诱导标记,P14-21时通过活体脑片提取标记神经元,进行Smart-seq2单细胞RNA测序,分析cPcdh异构体表达,并计算克隆内神经元对的表达相似性。

2

cPCDH功能缺失实验

验证减少功能性cPCDH表达对克隆相关神经元空间排列和突触连接的影响。

将Pcdhgfcon3/flox等位基因与MADM系统结合,产生Pcdhg-cKO克隆,通过3D重建测量神经元克隆的侧向和径向距离,并通过四重全细胞膜片钳记录评估突触连接率。

3

cPCDH过表达实验

验证过表达单一PCDHγC3亚型对克隆相关神经元空间排列和突触连接的影响。

将Pcdhgc3条件表达等位基因与MADM系统结合,产生Pcdhgc3过表达克隆,测量空间距离和突触连接率,并与WT比较。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
他莫昔芬SigmaT5648
4',6-二脒基-2-苯基吲哚SigmaD9542
鸡抗GFP抗体Aves labGFP-1020
兔抗RFP抗体Rockland600-401-379
兔抗CUX1抗体Santa Cruzsc-13024
兔抗Doublecortin抗体Cell Signaling Technology4604
大鼠抗CTIP2抗体Abcamab18465
山羊抗鸡IgY (H+L) 488ThermoA11039
驴抗兔IgG (H+L) Cy3Jackson ImmunoResearch711-165-152
驴抗大鼠IgG (H+L) 488ThermoA21208
杜氏改良Eagle培养基Thermo11995065
胎牛血清GE HealthcareSH30071.03HI
非必需氨基酸Thermo11140050
青霉素/链霉素Thermo10378016
Lipofectamine 3000转染试剂ThermoL3000150
固绿SigmaF7252
BTX ECM830电穿孔仪BTX--
曲拉通X-100Sigma93443
脱氧核糖核苷三磷酸NEBN0447
二硫苏糖醇Sigma43816
Oligo-dT30VN引物----
RNA酶抑制剂Takara2313
ERCC RNA加标混合物Thermo4456740
TD502建库试剂盒VazymeTD502
神经生物素Vector LabsSP-1120
Alexa Fluor 647偶联链霉亲和素ThermoS21374

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
MADM标记
他莫昔芬剂量(25-50 mg/kg)、给药时间(E12)、小鼠品系(Emx1-CreERT2;MADM)
阅读提示:Methods: Mice, Tamoxifen administration
单细胞RNA测序
细胞提取方法(玻璃微电极)、裂解缓冲液成分、cDNA扩增循环数(18-21)、测序平台(HiSeqX10或NovaSeq6000)
阅读提示:Methods: scRNA-seq
空间组织分析
3D重建方法、切片厚度、层边界识别、距离测量指标(侧向和径向)
阅读提示:Methods: Immunohistochemistry and 3D reconstruction
电生理记录
记录温度(32°C)、电极内液成分、刺激方案(去极化电流)、突触连接判定标准(平均突触后电流>0.5 pA)
阅读提示:Methods: Electrophysiology