克隆标记与cPcdh表达分析
建立MADM系统标记神经祖细胞克隆,探究克隆相关神经元中cPcdh的表达模式及其与谱系和空间位置的关系。
使用Emx1-CreERT2;MADM系统在E12诱导标记,P14-21时通过活体脑片提取标记神经元,进行Smart-seq2单细胞RNA测序,分析cPcdh异构体表达,并计算克隆内神经元对的表达相似性。
Patterned cPCDH expression regulates the fine organization of the neocortex
包含scRNA-seq分析、MADM谱系标记、功能缺失和过表达实验、电生理记录、体内发育时间点分析等多层级验证。
小鼠新皮层兴奋性神经元克隆(MADM标记) Pcdhg-cKO小鼠模型 Pcdhgc3过表达小鼠模型
E12时单次他莫昔芬诱导MADM标记 P14-21或P14-35进行表型分析 Pcdhg条件敲除或Pcdhgc3过表达 四重全细胞膜片钳记录 克隆神经元对的空间距离测量
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立MADM系统标记神经祖细胞克隆,探究克隆相关神经元中cPcdh的表达模式及其与谱系和空间位置的关系。
使用Emx1-CreERT2;MADM系统在E12诱导标记,P14-21时通过活体脑片提取标记神经元,进行Smart-seq2单细胞RNA测序,分析cPcdh异构体表达,并计算克隆内神经元对的表达相似性。
验证减少功能性cPCDH表达对克隆相关神经元空间排列和突触连接的影响。
将Pcdhgfcon3/flox等位基因与MADM系统结合,产生Pcdhg-cKO克隆,通过3D重建测量神经元克隆的侧向和径向距离,并通过四重全细胞膜片钳记录评估突触连接率。
验证过表达单一PCDHγC3亚型对克隆相关神经元空间排列和突触连接的影响。
将Pcdhgc3条件表达等位基因与MADM系统结合,产生Pcdhgc3过表达克隆,测量空间距离和突触连接率,并与WT比较。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| MADM标记 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 免疫组化 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma | D9542 |
| 鸡抗GFP抗体 | Aves lab | GFP-1020 | |
| 兔抗RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 兔抗CUX1抗体 | Santa Cruz | sc-13024 | |
| 兔抗Doublecortin抗体 | Cell Signaling Technology | 4604 | |
| 大鼠抗CTIP2抗体 | Abcam | ab18465 | |
| 山羊抗鸡IgY (H+L) 488 | Thermo | A11039 | |
| 驴抗兔IgG (H+L) Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| 驴抗大鼠IgG (H+L) 488 | Thermo | A21208 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo | 11995065 |
| 胎牛血清 | GE Healthcare | SH30071.03HI | |
| 非必需氨基酸 | Thermo | 11140050 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo | 10378016 | |
| 病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000150 |
| 病毒注射 | 固绿 | Sigma | F7252 |
| 电转 | BTX ECM830电穿孔仪 | BTX | -- |
| scRNA-seq裂解 | 曲拉通X-100 | Sigma | 93443 |
| 脱氧核糖核苷三磷酸 | NEB | N0447 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | 43816 | |
| Oligo-dT30VN引物 | -- | -- | |
| RNA酶抑制剂 | Takara | 2313 | |
| scRNA-seq | ERCC RNA加标混合物 | Thermo | 4456740 |
| scRNA-seq建库 | TD502建库试剂盒 | Vazyme | TD502 |
| 电生理 | 神经生物素 | Vector Labs | SP-1120 |
| Alexa Fluor 647偶联链霉亲和素 | Thermo | S21374 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MADM标记 | 他莫昔芬剂量(25-50 mg/kg)、给药时间(E12)、小鼠品系(Emx1-CreERT2;MADM) 阅读提示:Methods: Mice, Tamoxifen administration |
| 单细胞RNA测序 | 细胞提取方法(玻璃微电极)、裂解缓冲液成分、cDNA扩增循环数(18-21)、测序平台(HiSeqX10或NovaSeq6000) 阅读提示:Methods: scRNA-seq |
| 空间组织分析 | 3D重建方法、切片厚度、层边界识别、距离测量指标(侧向和径向) 阅读提示:Methods: Immunohistochemistry and 3D reconstruction |
| 电生理记录 | 记录温度(32°C)、电极内液成分、刺激方案(去极化电流)、突触连接判定标准(平均突触后电流>0.5 pA) 阅读提示:Methods: Electrophysiology |