建立Cdc7急性抑制系统
验证Cdc7对细胞增殖的必要性
生成Cdc7AS/AS ESC和MEF以及Cdc7AID/AID/Tir1 ESC、MEF和敲入小鼠，通过1NM-PP1抑制类似物敏感激酶或auxin降解Cdc7。
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通过靶向蛋白降解揭示不依赖CDC7的G1/S期转变
CDC7-independent G1/S transition revealed by targeted protein degradation
实验完整度
高包含体外细胞实验（ESC、MEF、人细胞）、体内小鼠实验、活细胞成像、定量蛋白质组学及非洲爪蟾卵提取物复制实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（ESC） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 人乳腺上皮细胞（MCF10A、HMEC） 人成纤维细胞（BJ、HDF）
重点核对
细胞类型：小鼠ESC、MEF、人MCF10A、HMEC、BJ、HDF等 Cdc7抑制方式：AID系统（500 μM IAA）或化学抑制剂（XL-413、TAK-931、PHA-767491） Cdk1抑制：Ro-3306（3-10 μM）或类似物敏感Cdk1AS/AS细胞（3MB-PP1） 细胞同步化：M期（诺考达唑）或G0期（血清/生长因子剥夺） 检测终点：细胞周期分布（BrdU/PI）、DNA纤维分析、活细胞成像（FUCCI）
摘要
哺乳动物细胞进入DNA合成（S期）是细胞分裂中的一个关键事件1。根据目前的细胞周期模型，Cdc7激酶是DNA复制的必要且限速的触发因子，与细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk2协同作用。在这里，我们利用化学遗传学系统，能够在体外培养细胞以及活体小鼠体内急性关闭Cdc7，表明Cdc7对于许多不同细胞类型的细胞分裂是非必需的。我们证明另一种细胞周期激酶Cdk1在循环细胞和退出静息状态的细胞中在G1/S转变期间也具有活性。我们表明Cdc7和Cdk1在G1/S转变期间发挥功能冗余作用，并且至少存在一种激酶才能允许进入S期。这些观察结果通过证明Cdk1在生理上调节细胞分裂周期中的两个不同转变，而Cdc7在DNA复制中发挥冗余功能，修正了我们对细胞周期进程的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Cdc7激酶对于细胞进入S期是否必需？Cdk1是否在G1/S转变中发挥作用？
- 核心机制
- Cdc7和Cdk1在G1/S转变中发挥功能冗余作用，至少一种激酶存在才能允许S期进入；Cdk1-cyclin B在S期起始时被激活并磷酸化Mcm蛋白。
- 主要证据
- 通过AID系统急性降解Cdc7或化学抑制，细胞仍能增殖；结合Cdk1抑制则阻断S期进入。Cdk1活性在G1/S期升高，并直接磷酸化Mcm2。
- 研究意义
- 修正了细胞周期模型，表明Cdc7并非普遍必需，Cdk1在生理上调节两个不同的转变；Cdc7抑制可能作为p53突变肿瘤的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
观察Cdc7缺失对细胞增殖的影响
评估Cdc7缺失是否阻止细胞分裂
通过细胞生长曲线、流式细胞术、DNA纤维分析、细胞周期分析检测细胞增殖和DNA复制。
体内验证Cdc7缺失的影响
验证Cdc7在活体小鼠中的必要性
对Cdc7AID/AID/Tir1小鼠给予auxin处理，检测Cdc7降解和器官增殖情况。
探究Cdc7缺失时细胞增殖的分子机制
确定哪种激酶在Cdc7缺失时驱动S期进入
敲除Cdk2或CDK2，检测Cdk1活性及Mcm磷酸化，并通过化学抑制Cdk1验证其必要性。
验证Cdk1在G1/S期的生理活性
确证Cdk1在S期进入中的直接作用
通过类似物敏感标记并结合活细胞成像，检测Cdk1底物磷酸化及细胞周期进程。
利用非洲爪蟾卵提取物验证Cdk1-cyclin B的作用
验证Cdk1-cyclin B在无细胞系统中促进DNA复制起始
在Cdc7抑制的卵提取物中加入不同cyclin-CDK复合物，检测DNA合成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Knockout DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| Cdc7降解 | 吲哚-3-乙酸 | Cayman Chemical | -- |
| Cdc7抑制 | 1NM-PP1 | Cayman Chemical | -- |
| Cdk1抑制 | 3MB-PP1 | Abcam | -- |
| Ro-3306 | Sigma | -- | |
| Cdc7抑制 | XL-413 | Sigma | -- |
| TAK-931 | MedChem Express | -- | |
| PHA-767491 | Sigma | -- | |
| 细胞同步化 | 诺考达唑 | Sigma | -- |
| DNA损伤分析 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗体 | 抗γH2AX phospho-S139抗体 | SCBT | sc-517348 |
| 免疫印迹 | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗Cdc7抗体 | Abcam | ab229187 | |
| 抗Gapdh抗体 | CST | D16H11 | |
| 抗Mcm2抗体 | Abcam | ab4461 | |
| 抗Mcm2 phospho-S27抗体 | Abcam | ab109459 | |
| 抗Mcm2 phospho-S40抗体 | Abcam | ab133243 | |
| 抗Mcm2 phospho-S53抗体 | Epitomics | 3386-1 | |
| 抗CDC7抗体 | MBL | K0070-3S | |
| 抗Cyclin A抗体 | SCBT | sc-596 | |
| 抗Cyclin B1抗体 | Abcam | ab181593 | |
| 抗Cyclin E1抗体 | SCBT | sc-481 | |
| 抗Cdk1抗体 | Abcam | ab71939 | |
| 抗Cdk2抗体 | SCBT | sc-163 | |
| 抗Chk1抗体 | CST | 2360S | |
| 抗Chk1 phospho-S317抗体 | CST | 12302S | |
| 抗Chk1 phospho-S345抗体 | CST | 2348S | |
| 抗KAP1抗体 | Bethyl | A300-274A-M | |
| 抗KAP1 phospho-S824抗体 | Bethyl | A300-767A-M | |
| 抗p53抗体 | SCBT | sc-393031 | |
| 抗Rb抗体 | CST | 9313S | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗硫代磷酸酯抗体 | Abcam | ab92570 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F3165 | |
| 细胞分选 | CytoPhase Violet染料 | BioLegend | 425701 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 亚细胞分离 | 细胞分离试剂盒 | CST | 9038 |
| 激酶活性测定 | 组蛋白H1 | EMD Millipore | -- |
| 细胞死亡分析 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | -- |
| DNA纤维分析 | CldU（5-氯-2'-脱氧尿苷） | -- | -- |
| IdU（5-碘-2'-脱氧尿苷） | -- | -- | |
| ProLong gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Millipore | -- |
| CRISPR/Cas9敲除 | lentiCRISPR v2质粒 | Addgene | #98291, #98293 |
| 质谱分析 | TMT标记试剂 | -- | -- |
| High-Select Fe-NTA磷酸化肽富集试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Sep-Pak固相萃取柱 | Waters | -- | |
| 高pH反相肽分级试剂盒 | Pierce | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| Stage-tip | -- | -- | |
| 硫代标记 | N6-呋喃甲基-ATPγS | Biolog | -- |
| 对硝基苄基甲磺酸酯 | -- | -- | |
| 活细胞成像 | SiR-Hoechst | Cytoskeleton, Inc. | -- |
| EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷） | Cayman Chemical | -- | |
| AFDye 488、568或647吡啶甲基叠氮化物 | Click Chemistry Tools | -- | |
| 免疫荧光 | 抗cyclin B1单克隆抗体 | CST | 12231 |
| 抗CDK1单克隆抗体 | Abcam | ab133327 | |
| 抗CDK1多克隆抗体 | Atlas Antibodies | HPA003387 | |
| 抗cdc2（CDK1）单克隆抗体 | CST | 9116 | |
| 抗CDK2单克隆抗体 | CST | 18048 | |
| 抗GMNN（Geminin）多克隆抗体 | Atlas Antibodies | HPA049977 | |
| 抗Flag单克隆抗体 | Sigma | F3165 | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 | |
| 非洲爪蟾卵提取物 | 蛋白酶K | Roche | -- |
| 重组cyclin-CDK复合物 | ProQinase | -- | |
| 细胞培养 | MEGM™乳腺上皮细胞生长培养基BulletKit™ | Lonza | -- |
| EMEM培养基 | ATCC | -- | |
| 成纤维细胞生长培养基 | Sigma | 116-500 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 马血清 | Gibco | -- | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Cdc7降解 | IAA浓度（500 μM）、处理时间 阅读提示：Methods: Cell culture |
| Cdc7化学抑制 | 抑制剂种类、浓度（XL-413 10-20 μM，TAK-931 500 nM，PHA-767491 3.75 μM） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| Cdk1抑制 | Ro-3306浓度（3-10 μM）和给药时机 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞同步化 | M期同步（50 ng/ml nocodazole 12h）或G0期同步（血清/生长因子剥夺48-72h） 阅读提示：Methods: Cell synchronization |
| 细胞周期分析 | BrdU脉冲时间（ESC 30min，其他细胞1h），PI染色，流式分析 阅读提示：Methods: Cell cycle analyses |
| DNA纤维分析 | CldU和IdU标记时间（各20分钟），裂解和伸展条件 阅读提示：Methods: DNA fiber assays |