建立COF-AID细胞系
实现快速可诱导地降解转录辅因子，以研究其对增强子活性的影响。
在HCT116细胞中建立亲本细胞系，稳定表达OsTir1连接酶；随后对八个辅因子基因进行AID标签的纯合敲入，创建COF-AID细胞系。通过Western blot和质谱验证辅因子降解效率。
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差异辅因子依赖性定义人类增强子的不同类型
Differential cofactor dependencies define distinct types of human enhancers
实验完整度
高包含STARR-seq增强子活性筛选、PRO-seq新生转录分析、qPCR验证、ChIP-seq、IF-FISH及STAP-seq等多层次功能验证和机制探讨。
主要模型
HCT116细胞系 K562细胞系 A549细胞系 CH12小鼠淋巴瘤细胞系 小鼠Mediator亚基敲除细胞系
重点核对
HCT116细胞中AID系统标签的COF降解效率，IAA处理1小时 STARR-seq增强子活性变化，参考集6249个增强子 MED14-AID细胞中P53靶基因诱导对MED14的依赖性，使用Nutlin-3a处理 BRD4-AID细胞中组蛋白基因和LTR12的转录对BRD4的依赖性 TATA盒和CCAAT盒对BRD4非依赖转录的必需性和充分性，通过STAP-seq突变和插入实验
摘要
所有多细胞生物都依赖于由基因组增强子调控的差异基因转录，增强子通过转录因子介导的辅因子招募发挥作用。新出现的证据表明，并非所有增强子都需要所有辅因子，但这些观察是否反映更一般的原理或不同类型的增强子仍不清楚。在这里，我们根据辅因子依赖性对人类增强子进行分类，并表明这些类别为理解增强子的序列和染色质多样性及其在不同基因调控程序中的作用提供了一个框架。我们使用STARR-seq在HCT116细胞中量化整个人类基因组的增强子活性，并快速降解八种辅因子。这识别出具有不同辅因子需求、序列和染色质特性的不同类型增强子，包括对核心Mediator亚基MED14或溴结构域蛋白BRD4的消耗分别不敏感的增强子，它们似乎调控不同的转录程序。特别地，经典Mediator似乎对P53响应性增强子是非必需的，且MED14耗尽的细胞能够诱导内源性P53靶基因。类似地，BRD4对于含有CCAAT盒和TATA盒的基因（包括组蛋白基因和LTR12反转录转座子）的转录以及热休克基因的诱导并非必需。这项通过辅因子依赖性对增强子的首次分类揭示了能够绕过广泛使用的辅因子的不同增强子类型，说明了激活转录的替代方式如何分离基因表达程序，并为理解增强子功能和调控特异性提供了一个概念框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类增强子是否具有不同的辅因子依赖性，并构成不同类型的增强子？
- 核心机制
- 增强子通过特定转录因子招募不同辅因子，部分增强子可绕过MED14或BRD4，如P53靶增强子不依赖MED14，TATA盒启动子不依赖BRD4，可能通过替代机制招募CDK9。
- 主要证据
- 通过STARR-seq在HCT116细胞中量化增强子活性，结合AID系统快速降解辅因子，聚类分析定义了四类增强子；PRO-seq和qPCR验证了P53靶基因在MED14缺失下正常诱导；STAP-seq突变实验证明TATA盒对BRD4非依赖转录的必要性和充分性。
- 研究意义
- 该分类为理解增强子功能和调控特异性提供了概念框架，并可能有助于确定精确调控基因表达的创新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组STARR-seq筛选增强子活性变化
在辅因子缺失条件下，系统量化全基因组增强子活性，以识别依赖不同辅因子的增强子。
用包含超过5000万个1.2kb基因组片段的STARR-seq文库转染COF-AID细胞，进行IAA或水处理，6小时后收获RNA，分析报告转录本，测量增强子活性。
聚类分析定义增强子类型
根据增强子对不同辅因子降解的响应，对增强子进行分组，以揭示共有的辅因子依赖性模式。
基于对BRD2、BRD4、P300/CBP、MED14和CDK7五种辅因子降解的log2倍变化值，对6249个参考增强子进行K-medoids聚类，定义了四个增强子组。
P53靶基因的Mediator依赖性分析
验证MED14非依赖的增强子是否对应特定的转录因子（如P53），并检查P53靶基因的诱导是否依赖于MED14。
通过PRO-seq测量MED14-AID细胞在Nutlin-3a处理下P53靶基因的新生转录，并用qPCR验证；进行MED1 ChIP-seq和IF-FISH检查Mediator结合。在人类和小鼠细胞中敲除或敲降不同Mediator亚基，检测P53靶基因的诱导。
BRD4非依赖的TATA盒启动子分析
探究BRD4非依赖增强子的序列特征（如TATA盒和CCAAT盒）及其对BRD4非依赖转录的贡献。
通过PRO-seq分析BRD4-AID细胞中组蛋白基因和LTR12的表达；通过qPCR检测LTR12在BRD4缺失下的上调；进行STAP-seq实验，突变或插入TATA盒和CCAAT盒，检测转录活性。
热休克基因的BRD4非依赖性验证
验证热休克基因的诱导是否不依赖BRD4，并探讨其替代机制。
在BRD4-AID细胞中热休克处理1小时，通过qPCR检测热休克基因表达；同时敲降SEC亚基AFF1和AFF4，检查对热休克基因诱导的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | SigmaAldrich | #F7524 | |
| L-谷氨酰胺 | LifeTech Austria/Invitrogen | #25030024 | |
| 吲哚-3-乙酸钠盐 | SigmaAldrich | #I5148-2G | |
| 药物处理 | Nutlin-3a | Sigma | #SML0580 |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | #11668027 |
| OptiMEM培养基 | Invitrogen | #31985062 | |
| RNA提取 | RNeasy Maxi试剂盒 | Qiagen | #75162 |
| RNeasy小型提取试剂盒 | Qiagen | #74104 | |
| RNA纯化 | Oligo-dT25磁珠 | Invitrogen | #61005 |
| TurboDNase I | Invitrogen | #AM2238 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | #A63882 | |
| mRNA反转录 | SuperScript III反转录酶 | Invitrogen | #18080093 |
| d(T)18引物 | NEB | #S1316S | |
| 随机六聚体引物 | Bioline | #38028 | |
| qPCR | SYBR Green荧光染料 | Promega | #A6002 |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | #11836170001 | |
| Benzonase核酸内切酶 | SigmaAldrich | #E1014-5KU | |
| 2x Laemmli缓冲液 | BioRad | #1610737 | |
| 蛋白凝胶 | BioRad | #4561083 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| ECL化学发光检测 | Bio-Rad | #170-5060 | |
| 质谱分析 | iST试剂盒 | PreOmics GmbH | #P.O.00027 |
| 纳升级高效液相色谱系统 | UltiMate 3000 RSLC nano | -- | |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-spray离子源 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| JailBreak 1.0适配器 | Phoenix S&T, Inc. | -- | |
| 捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 分析柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | 增殖实验 | -- | -- |
| 细胞计数 | Countess II细胞计数仪 | Thermo Fisher | #AMQAX1000 |
| 电穿孔 | Maxcyte STX电穿孔仪 | Maxcyte | Cat No. GOC1 |
| 细胞克隆筛选 | mCherry荧光蛋白 | -- | -- |
| 杀稻瘟菌素 | eubio | #ant-bl-10p | |
| DNA提取 | DNA提取液 | Biozym | #101094 |
| Western blot | V5标签抗体 | Thermo Fisher | #R960-25 |
| 质谱分析 | Proteome Discoverer软件 | Thermo Scientific | -- |
| MSAmanda软件 | -- | -- | |
| IMP-apQuant软件 | -- | -- | |
| Skyline-daily软件 | -- | -- | |
| STARR-seq | RNeasy Maxi试剂盒 | Qiagen | #75162 |
| Oligo-dT25磁珠 | Invitrogen | #61005 | |
| TurboDNase I | Invitrogen | #AM2238 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | #A63882 | |
| SuperScript III反转录酶 | Invitrogen | #18080093 | |
| KAPA 2x HiFi高保真聚合酶 | KapaBiosystems | #KK2601 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | #B23318 | |
| PRO-seq | 生物素标记的CTP | Perkin Elmer | #NEL542001EA |
| M280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | #112.06D | |
| 烟草酸性焦磷酸酶 | Biozym | #187005 | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | #M0201S | |
| KAPA扩增反应 | Roche | #7959028001 | |
| Ampure磁珠 | Beckman | #A63881 | |
| qPCR | Qiashredder离心柱 | Qiagen | #79654 |
| TurboDNase | Invitrogen | #AM2238 | |
| DNase失活试剂 | Ambion | #AM1906 | |
| dNTPs | NEB | #4475 | |
| RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher | #EN0531 | |
| SuperScript III反转录酶 | Invitrogen | #18080093 | |
| 二硫苏糖醇 | Invitrogen | -- | |
| 正向链缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| MED1 ChIP-seq | MED1抗体 | Bethyl | #A300-793A |
| RNase A | Sigma | R4642 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | #25530049 | |
| cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | #11873580001 | |
| MED1 IF-FISH | 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P4957 |
| 层粘连蛋白 | Corning | 354232 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| 牛血清白蛋白 | VWR | 102643-516 | |
| Stellaris RNA FISH洗涤液A | Biosearch Technologies | SMF-WA1-60 | |
| 去离子甲酰胺 | EMD Millipore | S4117 | |
| 无RNase水 | Life Technologies | AM9932 | |
| Stellaris RNA FISH杂交缓冲液 | Biosearch Technologies | SMF-HB1-10 | |
| Hoechst 33258染色液 | Life Technologies | H3569 | |
| 洗涤缓冲液B | Biosearch Technologies | SMF-WB1-20 | |
| Vectashield封片剂 | VWR | 101098-042 | |
| 指甲油 | Electron Microscopy Science Nm | 72180 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | RPI | -- | |
| MetaMorph采集软件 | -- | -- | |
| Hammamatsu ORCA-ER CCD相机 | Hammamatsu | -- | |
| STAP-seq | STAP-seq筛选载体 | -- | Addgene ID 125150 |
| STAP-seq内参载体 | -- | Addgene ID 125152 | |
| MaxCyte STX电穿孔仪 | MaxCyte | -- | |
| siRNA敲降 | 靶基因siRNA | IDT | -- |
| 热休克处理 | 过氧化氢 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| COF-AID细胞系生成 | OsTir1连接酶插入的ACTB基因座；AID标签敲入的COF基因及标签位置（N端或C端）；IAA处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell culture, Cloning and characterization of genome editing events; Figure 1b |
| STARR-seq | STARR-seq文库（基因组覆盖度、片段大小）；转染细胞数量；IAA处理时间（6小时）和浓度（500 μM）；重复数；spike-in添加比例 阅读提示：Methods: STARR-seq, STARR-seq spike-in controls; Figure 1a |
| PRO-seq | 细胞处理（IAA、Nutlin-3a）的时间点和浓度；重复数；spike-in控制（S2细胞比例） 阅读提示：Methods: PRO-seq; Figure 3d, 4f |
| P53靶基因诱导 | Nutlin-3a浓度（10 μM）和处理时间（3小时或6小时）；IAA预处理时间（3小时或12小时）；细胞系（MED14-AID, BRD4-AID, CDK9-AID, TAF1-AID等） 阅读提示：Methods: P53 induction for qPCR; Figure 3g, Extended Data Fig. 4i-l |
| STAP-seq | 寡核苷酸库的设计（240bp或250bp片段，突变和插入）；转染量；IAA处理时间（6小时）；重复数；spike-in比例 阅读提示：Methods: TATA- and CCAAT-box motif mutations oligo library, STAP-seq; Figure 4i,j |