表达纯化复合物组分
获得用于结构研究和生化分析的重组蛋白
分别克隆并在SF9昆虫细胞中表达SHOC2，在BL21DE3大肠杆菌中表达PP1C和MRAS Q71L，并通过亲和层析和凝胶过滤纯化。
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SHOC2-MRAS-PP1C 全磷酸酶复合物的结构-功能分析
Structure-function analysis of the SHOC2-MRAS-PP1C holophosphatase complex
实验完整度
高包含X射线晶体学、冷冻电镜、生物层干涉、分析超速离心、深度突变扫描及细胞功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
SF9昆虫细胞表达的SHOC2蛋白 BL21DE3大肠杆菌表达的PP1C和MRAS蛋白 MIA PaCa-2细胞（KRAS突变胰腺癌细胞系） 293T细胞
重点核对
SHOC2-MRAS-PP1C复合物冷冻电镜结构分辨率2.9Å SHOC2与PP1C、MRAS的结合界面及关键残基 MRAS GTP结合状态对复合物组装的必要性 深度突变扫描中SHOC2变体的功能评分阈值（GOF >0.6, LOF < -0.6） 疾病相关突变（如SHOC2 M173I、T411A等）的增强结合效应
摘要
受体酪氨酸激酶（RTK）-RAS信号通过下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联调节细胞增殖和存活。SHOC2-MRAS-PP1C全磷酸酶复合物通过去除RAF家族蛋白上的抑制性磷酸化来增强MAPK信号，是RTK-RAS信号的关键调节因子1。SHOC2与MRAS和PP1C形成三元复合物，该复合物的人类种系功能获得性突变导致先天性RASopathy综合征2-5。然而，该复合物的结构和组装尚不清楚。在此，我们使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析了SHOC2-MRAS-PP1C复合物2.9Å分辨率的结构。此外，我们定义了全酶相互作用的生物物理原理，阐明了复合物的组装顺序，并通过深度突变扫描系统性地探究了SHOC2几乎所有可能的错义变体的功能后果。我们证明SHOC2通过富含亮氨酸重复区域的凹面结合PP1C和MRAS，并通过含有隐蔽RVxF基序的N端无序区域进一步结合PP1C。最初的复合物形成由SHOC2-PP1C相互作用介导，并由GTP负载的MRAS结合而稳定。这些观察结果定义了RASopathies和癌症中的SHOC2突变如何稳定复合物成员间的相互作用以增强全磷酸酶活性。总之，这一综合性的结构-功能模型全面定义了SHOC2-MRAS-PP1C全磷酸酶复合物内的关键结合相互作用，为治疗开发提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SHOC2如何与PP1C和MRAS组装形成全磷酸酶复合物，以及该复合物的结构-功能关系如何？
- 核心机制
- SHOC2通过LRR凹面与PP1C和MRAS结合，其N端无序区域的RVxF基序增强与PP1C的相互作用；GTP结合状态的MRAS稳定复合物组装，PP1C去磷酸化RAF的S259位点以激活MAPK信号。
- 主要证据
- 通过X射线晶体学和冷冻电镜解析了apo-SHOC2和复合物结构；通过BLI和AUC证实MRAS-GTP促进三元复合物组装；深度突变扫描鉴定出关键功能残基；细胞实验验证了突变对MAPK信号的影响。
- 研究意义
- 该结构-功能图谱为理解RASopathy和癌症中SHOC2复合物突变的致病机制提供资源，并为靶向该复合物的治疗策略提供结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析SHOC2及复合物结构
确定apo-SHOC2和SHOC2-MRAS-PP1C复合物的三维结构
使用X射线晶体学解析apo-SHOC2结构（1.8Å），使用冷冻电镜解析复合物结构（2.9Å）。
验证复合物组装机制
探究复合物组装的顺序和MRAS GTP状态对组装的影响
通过生物层干涉（BLI）和分析超速离心（AUC）检测SHOC2、PP1C和MRAS的相互作用动力学。
深度突变扫描（DMS）功能筛选
系统评估SHOC2几乎所有错义变体对细胞功能的影响
构建包含约12000个SHOC2变体的文库，在KRAS突变细胞中表达，用trametinib处理或对照，比较变体丰度变化。
细胞功能验证
验证DMS筛选出的代表性GOF/LOF变体对MAPK信号和复合物形成的影响
在MIA PaCa-2细胞中敲除内源SHOC2并回补变体，检测低附着生长、免疫印迹和免疫共沉淀。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达 | pFastBac载体 | ThermoFisher | -- |
| pET21b载体 | ThermoFisher | -- | |
| 蛋白质纯化 | HisTrap柱 | Cytiva | -- |
| S200凝胶过滤柱 | GE LifeSciences | -- | |
| S75凝胶过滤柱 | GE LifeSciences | -- | |
| 核苷酸交换 | 碱性磷酸酶 | Sigma | P0114 |
| GppCp | Sigma | M3509 | |
| 结晶 | 聚乙二醇4000 | -- | -- |
| 冷冻电镜 | Quantifoil 1.2/1.3 300目金网栅 | Quantifoil Micro Tools GmbH | -- |
| Gatan Solarus等离子清洗机 | Gatan, Inc. | -- | |
| Vitrobot Mk IV | ThermoFisher | -- | |
| Titan Krios G3i电子显微镜 | ThermoFisher | -- | |
| BioQuantum K3相机 | -- | -- | |
| 冷冻电镜数据处理 | Relion 4.0beta2 | -- | -- |
| CTFFind 4.1.14 | -- | -- | |
| CisTEM 1.0.0beta | -- | -- | |
| Topaz | -- | -- | |
| 结构建模 | Chimera | -- | -- |
| 结构精修 | Phenix | -- | -- |
| Coot | -- | -- | |
| 生物层干涉 | ForteBio Octet Red-384系统 | ForteBio | -- |
| 链霉亲和素传感器 | -- | -- | |
| 分析超速离心 | Beckman Optima XLA超速离心机 | Beckman | -- |
| 分子动力学模拟 | Schrödinger Desmond | Schrödinger | -- |
| 分子建模与能量计算 | 分子操作环境 | Chemical Computing Group | -- |
| 结构分析 | SiteMap | Schrödinger | -- |
| DMS文库构建 | pMT_025载体 | -- | -- |
| Stbl4感受态细胞 | New England BioLabs | -- | |
| NheI限制酶 | -- | -- | |
| BamH1限制酶 | -- | -- | |
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| DMS建库测序 | Illumina Nextera XT平台 | Illumina | -- |
| Illumina Novaseq S4平台 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | -- | |
| 谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| DMS筛选 | 曲美替尼 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | Machery-Nagel | -- |
| PCR扩增 | Herculase II DNA聚合酶 | Agilent | -- |
| Q5 DNA聚合酶 | New England BioLabs | -- | |
| PCR产物纯化 | PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| Qiaquick纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| AMPure XP磁珠纯化试剂盒 | Beckman Coulter | -- | |
| 表达构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | E0554S |
| pDONR221载体 | -- | -- | |
| pLX307载体 | -- | -- | |
| Gateway LR Clonase II酶混合物 | ThermoFisher | #11791020 | |
| CRISPR | plentiCRISPR v2-Blast载体 | Addgene | 83480 |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 低附着生长实验 | 96孔超低吸附板 | Corning | 3904 |
| 细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 | |
| EnVision酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | |
| 4%-12% Bis-Tris凝胶 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iBlot 2干印迹系统 | Thermo Scientific | IB21001 | |
| Odyssey CLx红外成像仪 | LI-COR | -- | |
| 免疫沉淀 | FLAG M2磁珠 | Sigma | -- |
| 抗V5标签单克隆抗体磁珠 | MBL | M215-11 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫印迹抗体 | FLAG抗体 | Sigma | F7425 |
| PP1 alpha抗体 | Upstate | 06-221 | |
| Myc抗体 | Abcam | ab9106 | |
| V5抗体 | CST | 13202S | |
| HA抗体 | CST | 3724TS | |
| PP1CB抗体 | Thermo Scientific | PA5-78117 | |
| 转染 | pLX307载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | SHOC2在SF9昆虫细胞中的表达时间（72小时），PP1C和MRAS在BL21DE3中的诱导条件（IPTG，18℃过夜），以及MRAS的GppCp负载和EDTA处理。 阅读提示：Methods：SHOC2 Production, PP1C Production, MRAS Q71L Production |
| 结构测定 | apo-SHOC2结晶条件（350-600 mM MgNO3, 200 mM Tris pH 8.5, 23-30% PEG 4000），蛋白浓度6 mg/mL，以及cryo-EM网格制备（Quantifoil网格，0.025%氟化辛基麦芽糖苷，Vitrobot条件）。 阅读提示：Methods: Crystallization of apo-SHOC2, Cryo-EM sample preparation |
| 生物层干涉（BLI） | SHOC2生物素化并加载到SA传感器上；PP1C结合浓度范围（最高10μM）和MRAS结合步骤（饱和PP1C后）。 阅读提示：Methods: Bio-layer Interferometry (BLI) |
| 分析超速离心（AUC） | 蛋白浓度（SHOC2 7 μM, PP1C 10 μM, MRAS 20 μM），转速50000 RPM，温度20°C。 阅读提示：Methods: Sedimentation velocity – analytical ultracentrifugation (SV-AUC) |
| 深度突变扫描（DMS） | 细胞系（PA-TU-8902或MIA PaCa-2），trametinib浓度（10 nM），处理时间（16天），文库覆盖度（~12000变体），筛选阈值（scaled LFC GOF >0.6, LOF < -0.6）。 阅读提示：Methods: SHOC2 DMS Viability Screen, DMS analysis |
| 细胞功能验证 | MIA PaCa-2细胞中SHOC2 KO和回补变体，低附着培养7天，免疫印迹检测P-S259 RAF1和MAPK信号，免疫沉淀条件（细胞数、抗体量）。 阅读提示：Methods: Cell lines, Growth In Low Attachment Assays, Immunoblot Analysis, Immunoprecipitation studies |