肠道病毒感染小鼠模型建立
验证肠道病毒（MNV-1、EDIM、鼠星状病毒）在肠道中的复制情况，并作为后续研究的感染模型。
对10日龄幼鼠或6周龄成年鼠经口灌胃接种病毒（EDIM、MNV-1等），在不同时间点（6 hpi、1-10 dpi）分离肠道组织，通过TCID50或qPCR测定病毒滴度/基因组拷贝数。
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肠道病毒在唾液腺中复制并通过唾液传播
Enteric viruses replicate in salivary glands and infect through saliva
实验完整度
高包含小鼠体内感染模型（幼鼠和成年鼠）、唾液腺类球体、人类唾液腺细胞系及人诺如病毒培养等多种证据，并利用基因敲除、药理学抑制、免疫组化和病毒滴定等进行了功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠幼鼠（10日龄） BALB/c成年小鼠 小鼠唾液腺类球体（salispheres） 人唾液腺细胞系NS-SV-TT-DC/NS-SV-TT-AC
重点核对
病毒接种类型、剂量及途径：EDIM（100倍稀释的储液）和MNV-1（10^5 TCID50单位）经口灌胃（100 μl），成年鼠用6×10^6 TCID50单位 感染时间点：急性感染（MNV-1和EDIM）在3-5天达到峰值，7-10天清除；持续性感染（MNV-3、MNV-4、WU23）持续至少3周 2-CMC处理：体内腹腔注射50 μg/kg/day，体外培养12.5 μg/ml，用于验证MNV-1复制 细胞分选：使用抗EpCAM和抗CD45抗体分选唾液腺细胞群，EpCAM+上皮细胞和CD45+免疫细胞 使用Cd300lf基因敲除小鼠验证受体依赖性
摘要
诺如病毒、轮状病毒和星状病毒等肠道病毒长期以来被认为是通过粪-口途径在人群中传播的：病毒从宿主粪便中排出，进入另一宿主的口腔，绕过唾液腺（SGs），到达肠道进行复制、经粪便排出并重复传播周期。然而有些病毒（如狂犬病病毒）会感染唾液腺，使口腔成为复制部位之一，唾液成为传播途径之一。我们在此报道肠道病毒能高效且持续地感染唾液腺，其滴度可与肠道相当。我们证明肠道病毒会释放到唾液中，从而确定了病毒传播的第二条途径。这对受感染的婴儿尤其重要，他们的唾液在吮吸过程中通过返流直接将肠道病毒传播给母亲的乳腺。这绕过了传统的肠-乳腺轴途径，并导致母乳分泌型IgA抗体迅速激增。最后，我们证明唾液腺来源的类球体和细胞系能复制并繁殖肠道病毒，从而产生可扩展且易于管理的生产系统。总之，我们的研究揭示了肠道病毒的新传播途径，对治疗、诊断以及重要的卫生措施（防止通过唾液传播）具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道病毒是否能在唾液腺中复制并通过唾液传播？这种传播途径对母婴传播有什么影响？
- 核心机制
- 肠道病毒（诺如病毒、轮状病毒、星状病毒）能在唾液腺（特别是颌下腺）中高效复制，并通过唾液释放；在吮吸过程中，病毒从婴儿口腔返流至母亲乳腺，导致乳腺感染并刺激乳汁分泌型IgA抗体快速产生。
- 主要证据
- 多种小鼠模型（幼鼠、成年鼠、Cd300lf基因敲除小鼠、STAT1和IFNAR敲除小鼠）显示肠道病毒在颌下腺中复制（TCID50和qPCR检测），免疫荧光和细胞分选显示病毒在唾液腺上皮和免疫细胞中复制；唾液感染实验证实经口接种含病毒唾液可导致肠道感染；人类诺如病毒可在唾液腺细胞系和类球体中复制。
- 研究意义
- 研究揭示肠道病毒通过唾液传播的新途径，对疾病治疗、诊断和卫生措施（特别是防止通过唾液传播）具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
唾液腺感染与病毒复制检测
确定肠道病毒是否在唾液腺（特别是颌下腺）中复制，并比较不同病毒株的复制能力。
从感染的成年鼠和幼鼠中分离颌下腺（SMG），通过TCID50（MNV）或qPCR（EDIM、星状病毒）检测病毒滴度/基因组拷贝数；免疫荧光染色验证病毒蛋白（NS4、NSP5等）和细胞类型（上皮、免疫细胞）。
病毒通过唾液传播的验证
验证唾液是否含有传染性病毒，并证明通过唾液经口接种可导致感染。
使用毛果芸香碱刺激成年小鼠收集唾液，通过免疫印迹检测病毒蛋白（VP6、VP1），并测定MNV-1滴度；将感染小鼠的唾液经口接种给幼鼠，检测其肠道病毒复制。
母婴传播实验
探究感染幼鼠是否通过吮吸将病毒传播给母鼠乳腺，并触发乳汁sIgA反应。
幼鼠经口接种EDIM或MNV-1后与母鼠同笼，在不同时间点测量母鼠乳汁sIgA水平和乳腺中的病毒基因组拷贝数；通过母鼠/幼鼠交换实验进一步验证传播路径，并设置母鼠直接口服接种对照。
唾液腺类球体培养模型
建立体外唾液腺类球体（salispheres）培养系统，并验证肠道病毒在其中复制。
从小鼠唾液腺中分离上皮细胞，在Matrigel中培养形成类球体；用MNV-1、CR6或EDIM感染类球体，通过qPCR或TCID50检测复制，并用2-CMC处理验证特异性。
人唾液腺细胞系感染模型
评估人诺如病毒能否在人类唾液腺细胞系（NS-SV-TT-DC/AC）中复制，并优化感染效率。
将人诺如病毒GII.4（粪便衍生）或囊泡包裹型病毒感染NS-SV-TT-DC和NS-SV-TT-AC细胞，通过qPCR、免疫印迹（NS7、VP1等）和FISH（负链RNA）检测复制；比较游离病毒与囊泡包裹病毒的感染效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 |
| 胎牛血清 | Atlas Biologicals | EF-0500-A | |
| KGM-2角质细胞生长培养基套装 | Lonza | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 |
| Fluormount-G封片剂（含DAPI） | Electron Microscopy Sciences | 17984-24 | |
| Leica冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM3050S | |
| Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 通用HIER抗原修复液 | Abcam | ab208572 | |
| 免疫印迹 | Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 |
| SDS-PAGE凝胶 | Bio-Rad Laboratories | 4561034 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | 1704159 | |
| Tris缓冲盐溶液 | Bio-Rad Laboratories | 1706435 | |
| 吐温-20 | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| Lumigen ECL超敏发光液 | Lumigen | TMA-100 | |
| Amersham Imager 600成像系统 | GE Healthcare | 29083461 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Invitrogen | A32955 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad Laboratories | 1704157 | |
| qPCR | Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1672 |
| SYBR Green荧光染料 | Bio-Rad Laboratories | 1725124 | |
| Roche LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | 05815916001 | |
| TaqMan快速病毒一步法预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | |
| RNA提取 | Quick-RNA微型制备加强版试剂盒 | Zymo Research | R2001 |
| Quick-RNA微量制备加强版试剂盒 | Zymo Research | R1050 | |
| 细胞分选 | 温和胶原酶/透明质酸酶溶液 | Stemcell Technologies | 07919 |
| 抗EpCAM-APC抗体 | Thermo Fisher Scientific | 17-5791-82 | |
| 抗CD45-PE抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-0451-82 | |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34957 | |
| FACS ARIA III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSDiva 8.1软件 | BD Biosciences | -- | |
| 病毒滴度测定 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | HT901 |
| FISH | RNAscope多重荧光检测试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | 323110 |
| RNAscope蛋白酶III | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | |
| Opal 570染料 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | |
| RNAscope TSA缓冲液 | Advanced Cell Diagnostics | 322810 | |
| Fluoromount-G封片剂（含DAPI） | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | |
| 唾液IgA检测 | 分泌型免疫球蛋白A ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corporation | SEA641Mu |
| 动物实验 | 催产素 | Sigma-Aldrich | O3251 |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 七氟烷 | -- | -- | |
| 布比卡因 | -- | -- | |
| 2'-C-甲基胞苷 | -- | -- | |
| vesicle isolation | MagCapture外泌体分离试剂盒PS | Fujifilm Wako | 293-77601 |
| 细胞培养 | RAW264.7细胞 | ATCC | TIB-71 |
| HeLa细胞 | ATCC | CCL-2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染模型 | 动物品系、年龄和病毒株：BALB/c小鼠（6周龄成年和10日龄幼鼠）或基因敲除小鼠（Cd300lf-/-等）；病毒株包括MNV-1、EDIM、鼠星状病毒等，接种剂量和途径（经口灌胃，100 μl，剂量见方法），感染时间点（0-10 dpi等） 阅读提示：Methods部分 'Mouse model' 和 'Virus infection' |
| 唾液腺病毒复制检测 | 病毒接种后，在不同时间点（0-10 dpi）收集颌下腺（SMG），使用TCID50或qPCR测定病毒滴度/基因组拷贝数；检测方法（具体仪器、试剂）；阳性对照（如2-CMC处理）和阴性对照（mock） 阅读提示：Methods部分 'Virus infection' 和 'qPCR' |
| 唾液传播实验 | 成年小鼠接种病毒后，使用4%异氟烷麻醉和2%毛果芸香碱刺激收集唾液；通过免疫印迹检测病毒蛋白（VP1、VP6）或TCID50测定滴度；将收集的唾液经口接种幼鼠，并在3 dpi检测肠道病毒复制 阅读提示：Methods部分 'Saliva collection and infection' |
| 哺乳传播实验 | 幼鼠接种病毒后与母鼠同笼；母鼠乳汁sIgA水平和乳腺病毒基因组拷贝数的测量；母鼠/幼鼠交换实验的时间点（1 dpi交换，3 dpi检测）和对照组设置 阅读提示：Methods部分 'Milk extraction from dams' 和 'Foster mother experiment' |
| 唾液腺类球体培养与感染 | 类球体培养条件（基质胶、培养基）；感染条件（MOI或病毒量、感染时间）；病毒复制的检测（qPCR、TCID50） 阅读提示：Methods部分 'Cell culture' 和 'Virus infection' |
| 人唾液腺细胞系感染 | NS-SV-TT-DC和NS-SV-TT-AC细胞的培养条件（无血清培养基KGM-2）；感染病毒类型（GII.4-77.1或GII.4-WN）和形式（囊泡包裹或游离） 阅读提示：Methods部分 'Cell culture' 和 'Virus infection' |