TCA循环酶表达谱分析
评估TCA循环酶在肠道不同谱系中的表达异质性
利用公开scRNA-seq数据（GSE185224）和qPCR对Lgr5-GFP报告小鼠分选的细胞进行分析，并通过smFISH和免疫荧光验证，比较ISC、吸收谱系和分泌谱系中TCA循环酶表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
组织再生过程中代谢适应决定细胞命运
Metabolic adaptations direct cell fate during tissue regeneration
实验完整度
高包含体外类器官模型、转基因小鼠模型（TRE-shOgdh）、体内DSS结肠炎模型和免疫介导结肠炎模型，并包含功能验证（OGDH敲降、αKG补充）和机制验证（5hmC、HNF4调控）。
主要模型
小鼠肠道类器官（ISC富集、分泌祖细胞、吸收祖细胞） TRE-shOgdhCag-rtTA3小鼠（系统性OGDH敲降） TRE-shOgdhVillin-rtTA3小鼠（肠道特异性OGDH敲降） DSS诱导的结肠炎小鼠模型
重点核对
OGDH敲降或DM-αKG处理是否影响ISC向分泌谱系分化（类器官和体内） HNF4转录因子是否调控Ogdh启动子活性（ChIP和报告基因实验） OGDH敲降导致的细胞死亡是否由生物能量缺陷引起（DM-琥珀酸回补实验） OGDH抑制或αKG补充是否改善DSS结肠炎小鼠的组织修复
摘要
虽然细胞命运决定通常归因于转录调控，但新出现的数据也表明与中间代谢相关的分子发挥作用。例如，在三羧酸（TCA）循环中驱动能量产生和生物合成途径的α-酮戊二酸（αKG）也是染色质修饰酶的辅因子1-3。然而，TCA循环代谢物是否在组织稳态和再生过程中调控细胞命运仍不清楚。在此，我们显示TCA循环酶在肠道中以异质性方式表达，αKG脱氢酶复合物4-6的组分在吸收谱系中上调，在分泌谱系中下调。利用基因修饰的小鼠模型和类器官，我们揭示αKG脱氢酶复合物的酶亚基2-氧代戊二酸脱氢酶（OGDH）具有双重、谱系特异性的作用。在吸收谱系中，OGDH被HNF4转录因子上调，以维持肠细胞的生物能量和生物合成需求。在分泌谱系中，OGDH通过一个过程下调，该过程在建模时增加αKG水平并刺激分泌细胞的分化。与此一致，在分泌细胞分化和成熟受损的结肠炎小鼠模型中，抑制OGDH或补充αKG逆转了这些损伤并促进了组织愈合。因此，OGDH依赖性具有谱系特异性，其调控有助于指导细胞命运，为再生医学中的靶向治疗提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCA循环代谢物αKG及其代谢酶OGDH是否以及如何调控肠道干细胞命运和组织再生。
- 核心机制
- OGDH在吸收谱系中被HNF4转录因子上调以维持能量和生物合成需求；在分泌谱系中下调导致αKG积累，激活αKG依赖性双加氧酶（如TET酶），增加5hmC水平，促进分泌细胞分化。
- 主要证据
- scRNA-seq和qPCR显示OGDH在肠道谱系中异质性表达；类器官中OGDH敲降或DM-αKG处理促进分泌分化；HNF4调控Ogdh启动子；DSS结肠炎模型中OGDH抑制或αKG补充改善组织修复。
- 研究意义
- 该研究为靶向代谢干预（如αKG补充或OGDH部分抑制）治疗肠道炎症性疾病和促进组织再生提供了理论基础，可能也解释了αKG在缓解年龄相关组织衰退中的益处。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
类器官代谢谱分析
检测不同肠道祖细胞类器官的代谢物差异
通过LC-MS/MS分析ISC富集、分泌祖细胞（pSec1、pSec2）和吸收祖细胞（pAbs）类器官的代谢物组成，并进行13C-葡萄糖和13C-谷氨酰胺示踪，评估TCA循环通量。
OGDH功能研究
通过遗传和药理学操作确定OGDH在肠道分化中的谱系特异性作用
使用TRE-shOgdhCag-rtTA3小鼠来源的类器官，用doxycycline诱导OGDH敲降，或用DM-αKG处理，观察细胞增殖、分化和死亡表型。
机制研究
探讨OGDH调控的分子机制及其对分泌分化的影响
通过ChIP和报告基因实验验证HNF4对Ogdh启动子的直接调控；通过免疫荧光检测5hmC水平；通过RNA-seq分析下游基因表达变化。
体内验证
在体内验证OGDH敲降或αKG补充对肠道稳态和损伤修复的作用
使用TRE-shOgdhCag-rtTA3和TRE-shOgdhVillin-rtTA3小鼠，结合DSS诱导的结肠炎模型，给予doxycycline或DM-αKG治疗，评估体重、结肠长度、溃疡数、分泌细胞数量和组织学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Sigma-Aldrich | D8437 |
| 基质胶 | Cultek | 356231 | |
| B27添加剂 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A8199-10G | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050038 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630049 | |
| 重组小鼠EGF | Gibco | PMG8044 | |
| 重组Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 小鼠R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| 诺莫霉素 | InvivoGen | ant-nr-1 | |
| CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
| Y-27632 | PeproTech | 1293823 | |
| 丙戊酸 | Sigma-Aldrich | P4543 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| IWP2 | Sigma-Aldrich | I0536 | |
| 药物处理 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891-25G |
| 二甲基-α-酮戊二酸 | Sigma-Aldrich | 349631-5G | |
| 辛基-α-酮戊二酸 | Sigma-Aldrich | 876150-14-0 | |
| 辛基-L-2-羟基戊二酸 | Sigma-Aldrich | 1391194-64-1 | |
| 二甲基琥珀酸 | Sigma-Aldrich | W239607-1KG-K | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-1 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma | 111980050 | |
| 代谢分析 | 6545 Q-TOF质谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| 6230 TOF质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| XSelect HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Skyline软件 | -- | -- | |
| MassHunter Profinder软件 | Agilent Technologies | -- | |
| MetaboAnalyst软件 | -- | -- | |
| Thermo Vantage三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acquity UPLC HSS T3分析柱 | Waters | -- | |
| Seahorse分析 | Seahorse XF分析仪 | Agilent | -- |
| 线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| 底物氧化压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 流式细胞术 | Sony MA900细胞分选仪 | Sony | -- |
| BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | 蔡司AxioImager显微镜 | Zeiss | -- |
| Axiovision软件 | Zeiss | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 多重免疫荧光 | Comet Lunaphore平台 | Lunaphore | -- |
| CellDive平台 | -- | -- | |
| smFISH | Bioptechs盖玻片 | Bioptechs | 0420-0323-2 |
| 蛋白酶K | Sigma | 3115836001 | |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D8906-50G | |
| 酵母tRNA | Thermo Fisher Scientific | 15401029 | |
| 甲酰胺 | Thermo Fisher Scientific | AM9344 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Alexa Fluor染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 透射电子显微镜 | Tecnai 12电子显微镜 | FEI | -- |
| AMT BioSprint29数码相机 | AMT Imaging | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 硝酸纤维素膜 | LI-COR Biosciences | 926-31090 | |
| 抗OGDH抗体 | Proteintech | 15212-1-AP | |
| ECL检测试剂 | Cell Signaling Technology | 6883P3 | |
| ChIP | E220聚焦超声仪 | Covaris | PN |
| 抗HNF4α抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-199 | |
| 抗SMAD4抗体 | Cell Signaling Technology | 46535 | |
| qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74004 |
| TaqMan逆转录试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| ViiA 7实时PCR系统 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | 74004 |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| TruSeq链式mRNA LT试剂盒 | Illumina | RS-122-2102 | |
| HiSeq 4000/2500测序仪 | Illumina | -- | |
| Trimmomatic软件 | -- | -- | |
| STAR软件 | -- | -- | |
| featureCounts软件 | -- | -- | |
| DESeq2软件 | -- | -- | |
| pheatmap软件包 | -- | -- | |
| enrichR软件 | -- | -- | |
| 基因集富集分析软件 | -- | -- | |
| DNA甲基化分析 | BisulPlus位点5mC和5hmC检测PCR试剂盒 | -- | P-1067-48 |
| Quick-DNA小提Plus试剂盒 | Zymo Research | D4069 | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定活力染料 | Invitrogen | R37601 |
| Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | 564219 | |
| 抗CD45-APC抗体 | BioLegend | 103128 | |
| 抗CD45Rb-FITC抗体 | BioLegend | 103306 | |
| ELISA | 脂质运载蛋白2 ELISA试剂盒 | Abcam | ab199083 |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | MP-Biomedicals | 021160110-CF |
| 多西环素盐酸盐饲料 | -- | -- | |
| 溴脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002 | |
| ACK裂解缓冲液 | Quality Biologicals | 118-156-101CS | |
| CD4+细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-104-454 | |
| 分散酶 | Life Technologies | 17105041 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Roche | 04716728001 | |
| 细胞回收液 | Corning | 76332-050 | |
| TrypLE消化酶 | Life Technologies | 12604021 | |
| P3原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 4D-Nucleofector电转仪 | Lonza | -- | |
| 免疫荧光 | ProLong Gold封片剂 | Life Technologies | -- |
| 柠檬酸盐抗原修复液 | Vector Labs | H-3300-250 | |
| Tris-EDTA抗原修复液 | Vector Labs | H-3301-250 | |
| 透射电子显微镜 | Eponate 12树脂 | Ted Pella | -- |
| 免疫印迹 | SDS-PAGE凝胶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OGDH敲降实验 | OGDH敲降效率（shRNA靶点、诱导时间）、doxycycline浓度、处理时间（72h）、类器官培养代数 阅读提示：Methods: Generation of an inducible Ogdh-knockdown mouse, Organoid treatments |
| DM-αKG处理实验 | DM-αKG浓度（3.35 mM）、处理时间（72h）、给药途径（腹腔注射，300或600 mg/kg）、是否使用对照（PBS） 阅读提示：Methods: Organoid treatments, Mouse diets and treatments |
| 类器官分化实验 | 培养基组成（ENR-CV, ENR-CD, ENR-VD, ENR-IV）、细胞因子和抑制剂浓度（EGF, Noggin, R-spondin, CHIR99021, VPA, DAPT, IWP2）、分化时间（3-6天） 阅读提示：Methods: Organoid differentiation |
| DSS结肠炎实验 | DSS浓度（2%）、处理时间（5天）、小鼠品系、给药方案（doxycycline饮食或注射）、OGDH抑制的脉冲方案（3天ON/4天OFF）、DM-αKG剂量（300 mg/kg） 阅读提示：Methods: Mouse diets and treatments, Figure 5 legends |
| 体内OGDH敲降实验 | TRE-shOgdhCag-rtTA3或Villin-rtTA3小鼠、doxycycline饮食浓度（200 mg/kg）、处理时间（3-11天）、DSS处理的组合方案 阅读提示：Methods: Generation of an inducible Ogdh-knockdown mouse, Mouse diets and treatments |